JoVE Journal > Bioengineering
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Bioengenharia

Разработка моделей Drosophila melanogaster для визуализации и оптогенетического контроля сердечной функции

Published: August 25, 2022
doi:
10.3791/63939
, , , , ,
1Department of Biomedical Engineering,Washington University in St. Louis, 2Department of Computer Science and Engineering,Washington University in St. Louis

Summary

Настоящий протокол описывает генерацию Drosophila melanogaster , экспрессирующего eNpHR2.0 или ReaChR опсины в сердце для визуализации OCT и оптогенетической кардиостимуляции. Представлены подробные инструкции по визуализации Drosophila OCT и модуляции сердцебиения, включая моделирование восстановительной остановки сердца, брадикардии и тахикардии у живых животных на разных стадиях развития.

Abstract

Использование Drosophila melanogaster (плодовая муха) в качестве модельного организма обеспечило значительный прогресс во многих областях биологической науки, от клеточной организации и геномных исследований до поведенческих исследований. Благодаря накопленным научным знаниям, в последние годы дрозофила была выведена в область моделирования заболеваний человека, в том числе сердечных заболеваний. В представленной работе описана экспериментальная система мониторинга и манипулирования функцией сердца в контексте всего живого организма с использованием красного света (617 нм) и без инвазивных процедур. Контроль над сердцем достигался с помощью оптогенетических средств. Оптогенетика сочетает в себе экспрессию светочувствительных трансгенных опсинов и их оптическую активацию для регулирования интересующей биологической ткани. В этой работе была использована специальная интегрированная оптическая когерентная томография (ОКТ) и система оптогенетической стимуляции для визуализации и модуляции функционирующего сердца D. melanogaster на 3-й стадии развития личинки звезды и ранней стадии развития куколки. Двойная генетическая система UAS/GAL4 использовалась для экспрессии галорходопсина (eNpHR2.0) и каналародопсина с красным смещением (ReaChR), особенно в сердце мухи. Приведены подробные сведения о подготовке D. melanogaster к визуализации OCT в реальном времени и оптогенетическому кардиостимуляции. Разработанное в лаборатории интеграционное программное обеспечение обрабатывало данные визуализации для создания визуальных представлений и количественных характеристик функции сердца дрозофилы . Результаты демонстрируют возможность инициирования остановки сердца и брадикардии, вызванных активацией eNpHR2.0, и выполнения кардиостимуляции при активации ReaChR.

Introduction

В конце 2010 года журнал Nature Methods выбрал оптогенетику в качестве метода года1. Использование генетических инструментов (трансгенных опсинов), регулируемых светом, для контроля биологических тканей, представляющих интерес, с беспрецедентной точностью и скоростью открыло шлюз для новых применений. На сегодняшний день большинство достижений относятся к нейробиологии. Технология была внедрена как новый метод точного управления одиночными нейронами2 и продвинулась к открытиям в области когнитивных функций живого организма3. С самого начала нейробиологи продемонстрировали способность модулировать поведение всего организма. Экспрессия и легкая активация опсина ChR2 у дофаминергических нейронов мышей вызывали их активацию и были достаточными для управления поведенческим обусловливанием4. Оптогенетическое ингибирование подмножества нейронов, содержащих галорходопсин NpHR2.0, доставляемых в эпилептический очаг мозга грызунов, приводило к ослаблению электроэнцефалографических припадков5.

Оптогенетические приложения в кардиологии развиваются устойчивыми темпами6. ChR2 успешно экспрессировался в культуре клеток кардиомиоцитов и у мышей; кардиостимуляция проводилась вспышками синего света (выполнялась с использованием имплантированного волокна у живых животных)7. У рыбок данио ChR2 экспрессировался и использовался для идентификации области сердца, вызывающей темп; Активация NpHR индуцировала остановку сердца8. Оптогенетическая кардиостимуляция обладает уникальным потенциалом для разработки новых методов кардиостимуляции и ресинхронизирующейтерапии 9. Попытки установить систему прекращения аутогенной аритмии были зарегистрированы в последнее время, а также10.

Обширные исследования и разработка новых терапевтических методов лечения требуют применения различных модельных систем, от клеточной культуры до млекопитающих. Сердце позвоночных является очень сложным органом. Кардиомиоциты (КМ) составляют треть всех сердечных клеток; другие клетки включают нейроны, гладкомышечные клетки сосудов и невозбудимые клетки (то есть эндотелиальные клетки, фибробласты и иммунные клетки). Исследование клеточной культуры СМ ограничивает трансляцию полученных результатов в медицинские приложения человека. Генетические манипуляции модельных организмов млекопитающих ограничены и отнимают много времени. Меньшие модели беспозвоночных имеют много преимуществ; их сердечно-сосудистая система несет в себе все необходимые гистологические элементы. Drosophila melanogaster (плодовая муха) представляет собой простую и мощную генетическую модельную систему для исследования роли генов, связанных с заболеваниями человека, включая сердечные заболевания 11,12,13. Как недолговечные животные, плодовые мушки представляют собой прекрасную возможность для моделирования возрастных или зависимых от болезней изменений сердечной функции, которые можно проследить на протяжении всей жизни 14,15,16,17. Сердечная трубка плодовой мухи расположена на спинной стороне ее тела в пределах 200 мкм от поверхности кутикулы, что позволяет видимому ближнему инфракрасному свету достигать сердечной трубки. Эта анатомическая особенность позволяет неинвазивное оптическое измерение сердца дрозофилы с использованием существующих оптогенетических инструментов.

Для мониторинга сердца дрозофилы была разработана специальная спектрально-доменная оптическая когерентная томография (SD-OCT) с интегрированным модулем возбуждения светодиодного возбуждения красного света18. Морфологические и ритмические изменения в относительно простом сердце плодовой мухи могут быть легко проанализированы с помощью этой неинвазивной биомедицинской технологии визуализации 12,19,20,21. Благодаря улучшенной производительности оптического сечения и пространственному разрешению в микронном масштабе, OCT успешно используется для исследования структуры и мониторинга функции сердца дрозофилы на разных стадиях развития, включая 3-ю звездную личинку и раннюю куколку18. Эта система также позволяет одновременно контролировать и стимулировать сердечное состояние дрозофилы у интактного животного. Схематическое представление системы центр развертывания Office показано на рисунке 1. Система SD-OCT использует сверхлюминесцентный диод (SLD) в качестве источника света (центральная длина волны: 850 нм ± 10 нм, FWHM: 165 нм, см. Таблицу материалов). Используя объективную линзу 10x, система визуализации OCT может достичь осевого разрешения ~ 4,4 мкм в воздухе и ~ 3,3 мкм в ткани и бокового разрешения ~ 2,8 мкм, достаточного для разрешения мелких деталей структур сердца мухи18,22. Интерференционные сигналы отраженного света от опорного рычага и образца манипулятора обнаруживаются с помощью спектрометра с 2048-пиксельной линейной сканирующей камерой (максимальная скорость линии: 80 кГц, см. Таблицу материалов). Измеренная чувствительность системы составляет ~95,1 дБ. Каждое сканирование центра развертывания Office в B-режиме создает изображение поперечного сечения в плоскости изображения xz. Повторяющиеся изображения B-режима получаются в одном и том же месте для создания изображений M-режима, захватывающих бьющееся сердце более 30 с 18,22,23. Частота кадров для изображения в М-режиме составляет ~ 125 кадров / с, что достаточно для захвата динамики биения сердца плодовой мухи.

Для оптогенетической регуляции функции сердца дрозофилы модуль освещения со светодиодным источником света 617 нм интегрирован с образцовым рычагом системы SD-OCT. Стимулирующий свет фокусируется на точке диаметром ~ 2,2 мм на поверхности образца, в том же положении, что и точка фокусировки изображения. Специально написанное программное обеспечение используется для управления режимом освещения (интенсивность света, ширина импульса и рабочий цикл), регулировки частоты стимуляции светового импульса и синхронизации освещения светодиодного модуля и получения изображений OCT в М-режиме22.

В недавних публикациях описывалась трансгенная система Drosophila, состоящая из пространственно-височно регулируемых chR2, ReaChR и eNpHR2.0 опсинов с использованием генетической системы UAS/GAL4. Полученные результаты продемонстрировали способность инициировать остановку сердца и брадикардию, вызванную активацией красным светом eNpHR2.0 и более высокочастотной кардиостимуляцией, вызванной активацией синим светом ChR2. Аналогичные эксперименты были проведены с другим канальнымродопсином, ReaChR, индуцируемым освещением красным светом 22,23,24. Экспрессия опсина во всех описанных экспериментах была обусловлена 24B-GAL4, где экспрессия опсина наблюдалась в широком спектре тканей, включая кардиомиоциты и окружающие мышечные клетки. В текущем исследовании 24B-GAL4 был заменен драйвером Hand-GAL4 для достижения экспрессии опсинов eNpHR2.0 и ReaChR, специфичных для сердца.

В целом, представленные экспериментальные результаты демонстрируют восстановительную остановку сердца и индуцируемую брадикардию и тахикардию сердечных заболеваний. Приведен подробный протокол с пошаговыми инструкциями по созданию трансгенных моделей дрозофилы и проведению одновременной ОКТ-визуализации и экспериментов с оптогенетическим темпом у живых животных.

Protocol

Для настоящего исследования трансгенная линия eNpHR2.0 w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2, трансгенная линия ReaChR w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO, а также специфический для сердца драйвер GAL4, содержащий регуляторный фрагмент гена Hand w[1118]; Использовались P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] (этот запас драйверов будет указан как Hand-GAL4). y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 использовался в качестве репортерной линии GFP. Упомянутые запасы дрозофилы были получены из Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC, см. Таблицу материалов) и поддерживались при комнатной температуре или при 18 °C на стандартных средах кукурузной муки. Модели дрозофилы, разработанные в этом исследовании, доступны по запросу для совместной работы. 1. Генетические скрещивания дрозофилы и подготовка сред Изменить балансировщик 3-й хромосомы TM3 Sb[1] на TM6 Sb Tb, создав w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM6 Sb Tb (Hand-GAL4/TM6 Sb Tb). Схему пересечения см. на дополнительном рисунке 1 . Устанавливают крестики во флаконы с обычной средой из кукурузной муки.ПРИМЕЧАНИЕ: Наличие маркера Tb позволяет пользователям отличать личинок и куколок, содержащих трансген опсина, и драйвер GAL4 от животных, содержащих опсин, но без водителя25. Храните генетические кресты в инкубаторе влажности 25 °C, 70% на специально разработанных полностью транс-сетчатках (ATR)-содержащих средах (см. Таблицу материалов) в темноте в течение 5 дней для сбора личинок и 6 дней для сбора куколок. Объедините пять первичных самок Hand-GAL4 / TM6 Sb Tb и двух-трех самцов из запасов UAS-опсина (eNpHR2.0 или ReaChR) на флакон. Смотрите перекрестную диаграмму для eNpHR2.0 и ReaChR opsin на рисунке 2A и рисунке 2B соответственно. На следующий день приготовьте АТР-содержащие медиа-флаконы.Готовьте полуопределенную пищу в соответствии с инструкциями BDSC26. Вместо сахарозы и глюкозы добавляйте только сахарозу (5,14 г/100 мл). Остудить до ~60 °C при постоянном перемешивании. Приготовьте узкие флаконы и добавьте 50 мкл 100 мМ раствора ATR-этанола в каждый флакон. Используя серологическую пипетку, утилизируйте корм для мух в узкие флаконы, 5 мл на флакон. Вихрь на максимальной скорости в течение 10 с. Заткните флаконы и заверните их в темную ткань, чтобы защитить их от света. Дайте флаконам высохнуть не менее 12 ч (на ночь). На следующий день переведите мух, неуклонно откладывающих яйца с Шага 1.3. во флаконы с АТР-содержащим пищевым продуктом (Этап 1.4.4.). Защитите стеллажи флаконами от света. Через 24-48 ч (в зависимости от количества отложенных яиц) выбросьте родителей, чтобы предотвратить перенаселение флаконов. Соберите потомство, не относящееся к туберкулезу , и используйте его для визуализации сердца.ПРИМЕЧАНИЕ: Фенотипические различия на личиночной и куколочной стадиях показаны на рисунке 2C. Сводка и приблизительная временная шкала этапов подготовки образца показаны на рисунке 3. 2. Оптогенетический контроль сердца дрозофилы Выделите из флакона ЛИЧИНКУ UAS-opsin/Hand-GAL4 (Шаг 1.7.), нанесите на ткань и аккуратно вытрите носитель с поверхности тела с помощью малярной кисти. Подготовьте слайд микроскопа и поместите небольшой кусочек двусторонней ленты посередине. С помощью щетки или тонкого пинцета аккуратно поместите личинку/куколку на поверхность ленты спинной стороной вверх и перпендикулярно длинной стороне слайда. Приложите мягкое давление, чтобы прикрепить личинку/куколку к поверхности ленты. Установите слайд на стадии визуализации, личинка/куколка обращена вниз. Включите источник света OCT с помощью программного обеспечения для управления лазером (см. Таблицу материалов). Откройте специально написанное программное обеспечение управления SD-OCT и нажмите на окно предварительного просмотра . Задайте параметры сканирования в программном обеспечении SD-OCT.ПРИМЕЧАНИЕ: Цель состоит в том, чтобы выровнять образец для оптимальной визуализации бьющегося сердца, поэтому выбор диапазона X и диапазона Y охватывает область сердца. На этом этапе количество как A-сканов, так и B-сканов составляет 400. Диапазон в направлениях x и y составляет ~490 мкм и ~537 мкм, показывая два ортогональных поперечных сечения сердца (xz и yz) соответственно. Используйте микроманипуляторы для управления стадией образца, чтобы сфокусировать сердце мухи. Отрегулируйте фокусное положение, чтобы свести к минимуму отражение света от поверхности мушки. Рассмотрите возможность нанесения минерального масла на поверхность личинок / куколок, чтобы свести к минимуму отражение.ПРИМЕЧАНИЕ: Масло может увеличить риск передвижения животных, ставя под угрозу адгезионные свойства ленты. Убедитесь, что сердце мухи может быть полностью просмотрено в окне изображения без каких-либо искажений, заблокированных тканью и немалыми тенями и отражениями; в противном случае вернитесь к шагу 2.7. Задайте параметры сканирования для получения изображений центра развертывания Office в режиме M.ПРИМЕЧАНИЕ: Количество A-сканирований уменьшено по сравнению с шагом 2.7. для более быстрой частоты кадров для захвата динамики биения сердца мухи (несколько Гц). Количество B-сканов обозначает количество повторяющихся кадров для изображения в М-режиме, которое может быть скорректировано в зависимости от времени записи и доступной системной памяти. В этом эксперименте 128 A-сканирований могут обеспечить скорость ~ 125 кадров / с, и 4000 повторных B-сканирований записываются, обеспечивая непрерывную запись ~ 32 с. Получите пять наборов контрольных данных без импульсов стимуляции красным светом для расчета частоты сердечных сокращений в состоянии покоя (RHR). Проектирование светового импульса для стимуляции темпа в пользовательском программном обеспечении управления OCT. В разделе «Настройки» добавьте разработанные последовательности световых импульсов для управления частотой импульсов, шириной импульса, длительностью стимуляции и временем ожидания в соответствии с различными протоколами стимуляции.ПРИМЕЧАНИЕ: RHR измеряется на основе контрольного эксперимента без светового освещения и используется для расчета частоты, с которой свет должен быть импульсным для экспериментов с тахипацией и брадипаундированием22. Откройте программное обеспечение контроллера света (см. Таблицу материалов) для генерации импульсов красного света. Выберите импульсный режим в разделе «Выбор режима». Дважды щелкните рисунок для настроек «Pulse Profile» и выберите «Режим подписчика». Сохраните интенсивность OFF как 0 и установите процент интенсивности ON при расчете фактической плотности мощности.ПРИМЕЧАНИЕ: Стимулирующие световые импульсы запускаются сигналом от программного обеспечения управления OCT в соответствии с настройками, указанными в шаге 2.12. Получите видео в М-режиме бьющегося сердца дрозофилы со световой стимуляцией, нажав на Получить в программном обеспечении управления OCT. Повторите измерения 5x. 3. Анализ изображений Откройте специально разработанное программное обеспечение для сегментации сердца мух. Нажмите Выбрать файл, а затем выберите файл для анализа в появившемся графическом интерфейсе. Введите вертикальные и горизонтальные границы области сердца в пикселях в верхних текстовых полях. Нажмите Изменить размер. Используя ползунок внизу, убедитесь, что вся область сердца видна и что она заполняет всю коробку для всей коллекции. Если это не так, повторите этот процесс и скорректируйте границы. Нажмите « Предсказать », чтобы предсказать область сердца. Теперь программа будет проходить через каждый кусочек в коллекции и выбирать область сердца, занимая примерно 3 минуты. Нажмите на HR Plot после завершения прогноза. Это откроет новое окно, отображающее график области сердца с течением времени. Убедитесь, что выбраны правильные пиковые или долинные участки. Выберите Pulse , а затем HR , чтобы сгенерировать окончательную цифру, и функциональные параметры будут сохранены в файлах .csv одновременно.

Representative Results

D. melanogaster животных, экспрессирующих чувствительные к красному свету опсины eNpHR2.0 или ReaChR в сердечной трубке, были получены путем получения потомства из скрещивания между каждой трансгенной линией UAS-opsin и драйвером Hand-GAL4 . Тканевая специфичность драйвера GAL4 была проверена путем визуализации экспрессии GFP (рисунок 4). Личинка дрозофилы 3-й звезды и ранние стадии развития куколки были использованы для демонстрации эффектов активации eNpHR2.0 и ReaChR красным светом. Разработанные ~ 617 нм импульсы красного света, доставляемые светодиодом, освещали личинку / куколку и активировали eNpHR2.0 и ReaChR в сердце. Хотя заявленная максимальная длина волны отклика NpHR составляет ~ 580 нм, а ReaChR составляет ~ 600 нм, световое освещение 617 нм может проникать глубже с усиленной доставкой световой энергии к опсин-экспрессирующей сердечной ткани22. Установленная на слайде микроскопа спинной стороной вниз в установке инвертированного микроскопа, личинка/куколка освещалась светодиодным световым лучом, направленным на сегмент тела A7. Примеры изображений поперечного сечения корпуса показаны на рисунках 5A и 6A. Сердце появляется в виде сжимающейся и расширяющейся круглой формы в видеозаписях, состоящих из 4000 кадров (Дополнительные видео 1-6). Чтобы имитировать различные сердечные заболевания, были разработаны четыре типа световых импульсов. Один импульс продолжительностью 10 с после 5 секунд ожидания генерировал восстановительную остановку сердца, вызванную eNpHR2.0, как показано на рисунке 5B. Для кардиостимуляции на частотах, более медленных, чем частота сердечных сокращений в состоянии покоя (RHR), опосредованной eNpHR2.0, использовались две последовательности световых импульсов с частотами темпа, равными RHR/2 и RHR/4 продолжительностью 8 с с временем ожидания 6 с между ними (рисунок 5C). Рабочий цикл каждой последовательности световых импульсов составлял 90%. Этот режим легкой стимуляции вызвал состояние сердца, напоминающее брадикардию. Схема стимуляции для увеличения частоты сердечных сокращений за счет активации ReaChR состояла из трех последовательностей световых импульсов на частотах RHR + 0,5 Гц, RHR + 1 Гц и RHR + 1,5 Гц соответственно с шириной импульса 20 мс (рисунок 5D). Этот режим пульса был направлен на то, чтобы вызвать тахикардическое состояние сердца. Плотность мощности света составляла 7,49 мВт/мм2 во время всех экспериментов. Для контрольных экспериментов световое освещение не устанавливалось. Каждый экспериментальный вариант регистрировался пять раз. M-режимные видео сердца мухи были обработаны в 2D-маски с помощью FlyNet 2.027. Это программное обеспечение автоматически сегментирует область сердца для получения наборов данных о сердечной функции. Программа предоставляет маску сердца в каждом кадре, которая может быть дополнительно скорректирована вручную, если это необходимо, для получения точной количественной оценки функциональных параметров бьющегося сердца, таких как частота сердечных сокращений (HR), конечная диастолическая размерность (EDD) и конечная систолическая размерность (ESD), дробное укорочение (FR), конечная диастолическая область (EDA), конечная систолическая область (ESA) и т. Д. Частота сердечных сокращений измеряется путем анализа области сердца с течением времени. Контрольное видео без световых импульсов используется для установления базовой частоты сердечных сокращений (например, RHR) для каждого животного. На рисунках 5B и 6B показана остановка сердца длиной 10 с, вызванная активацией Hand>eNpHR2.0 с использованием красного света (617 нм) у личинок и куколок соответственно. Когда зажегся красный свет, сердце дрозофилы перестало биться и оставалось в этом состоянии до конца светового освещения. Функция сердца была восстановлена после выключения красного света. Животные, у которых не было экспрессированного опсина (контроль «без опсина»), не реагировали на освещение красным светом (дополнительный рисунок 2A и дополнительный рисунок 3A). Контрольные эксперименты с животными Hand>eNpHR2.0 , у которых не была включена подсветка красного света 10 с (контроль «без света»), показали, что сердце бьется нормально (дополнительный рисунок 4A и дополнительный рисунок 4C). С использованием животных Hand>eNpHR2.0 применялись импульсы красного света на частотах ниже RHR. Частота сокращения сердца снижалась вслед за световыми сигналами; этот более медленный сердечный ритм имитирует один тип сердечной аритмии, брадикардию (рисунок 5C и рисунок 6C для личинки и куколки, соответственно). Более медленная кардиостимуляция не наблюдалась в контрольных экспериментах «без опсина» (дополнительный рисунок 2B и дополнительный рисунок 3B) и в контрольных экспериментах «без света» (дополнительный рисунок 4A и дополнительный рисунок 4C). Увеличение частоты сердечных сокращений может быть достигнуто путем активации Опсина Hand>ReaChR с помощью импульсных поездов красного света на частоте, превышающей RHR данного животного. Серия из трех световых импульсных поездов на разных частотах стимуляции (например, RHR + 0,5 Гц, RHR + 1 Гц, RHR + 1,5 Гц) была нанесена на сердца личинок и куколок Hand>ReaChR . Полученные данные наглядно показывают увеличение частоты сердечных сокращений после световых импульсов (рисунок 5D и рисунок 6D для личинок и куколок соответственно). Состояние сердца, продемонстрированное в этих экспериментах, имитирует тахикардию. Отрицательные контрольные эксперименты показаны на дополнительном рисунке 2C, дополнительном рисунке 3C и дополнительном рисунке 4B,D. В целом, результаты демонстрируют целесообразность неинвазивного и специфического оптогенетического контроля сердечного ритма на различных стадиях развития на трансгенных животных моделях D. melanogaster. Рисунок 1: Система визуализации OCT, интегрированная со светодиодным модулем 617 нм для оптогенетического контроля функции сердца дрозофилы . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 2: Генерация D. melanogaster у животных, экспрессирующих опсин в сердце. (А) Генетическая перекрестная диаграмма. Самки Hand-GAL4/TM6 SbTb были скрещены с самцами, несущими eNpHR2.0. Полученное потомство Hand-GAL4/eNpHR2.0 (отмеченное красной звездой) было собрано для визуализации OCT, а Hand-GAL4/TM6 Sb Tb были отброшены на основе их фенотипического внешнего вида. (B) Генетическая перекрестная диаграмма. Самки Hand-GAL4/TM6 SbTb были скрещены с самцами, несущими ReaChR. Полученное потомство Hand-GAL4/ReaChR (отмеченное красной звездой) было собрано для визуализации OCT, а Hand-GAL4/TM6 Sb Tb были отброшены на основе их фенотипического внешнего вида. (C) Фенотипические различия между потомством Hand-GAL4/opsin (красная звезда) и Hand-GAL4/TM6 Tb . Животные, несущие мутацию гена Tb на хромосоме TM6 , имеют «трубчатую» форму тела по сравнению с нормальной, не-Tb личинкой или куколкой. На левой панели изображены личинки; на правой панели изображены ранние куколки. Изображения также включают линейку с отметками 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 3: Схематическое представление и временная шкала процедур подготовки изображений. Родительские запасы хранятся в флаконах; девственные самки и самцы скрещиваются в узких флаконах, наполненных обычной пищей (обозначены желтым цветом). Активно яйцекладущие мухи переносятся в ATR-содержащие среды (показаны в коричневых) флаконах. Флаконы с развивающимся потомством нужно держать в неведении от этого шага. Личинки 3-й звезды и ранние куколки собираются со стенок флакона для визуализации. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 4: D. melanogaster ранняя куколка, экспрессирующая UAS-GFP (BDSC 6658), приводимая в движение Hand-GAL4 (BDSC 48396). Паттерн флуоресценции подтверждает специфичность сердца драйвера Hand-GAL4 . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 5: Моделирование остановки сердца, брадикардии и тахикардии у личинки D. melanogaster . (A) Oct изображение поперечного сечения тела личинки. Сердце выглядит как круг под поверхностью тела. (B) Графическое представление восстановительной остановки сердца. Верхняя панель показывает время (ось X) освещения красным светом (ось Y, процент уровня мощности источника света). Средняя панель показывает изменение площади сердца (ось Y, квадратные микрометры) с течением времени (ось X). Нижняя панель показывает изменение частоты сердечных сокращений (ось Y, герц) с течением времени (ось X). (C) Графическое представление eNpHR2.0-опосредованной восстановительной брадикардии. Верхняя панель показывает импульсы освещения красным светом, вызывающие два периода брадикардии: 50% RHR и 25% RHR. Изменения области сердца и частоты сердечных сокращений отображаются на средней и нижней панелях соответственно. (D) Графическое представление кардиостимуляции активированным ReaChR. Верхняя панель показывает серию импульсов красного света 20 мс, возникающих на частотах RHR + 0,5 Гц, RHR + 1 Гц и RHR + 1,5 Гц. Сердечные сокращения следуют частотам светового импульса, как показано на средней и нижней панелях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Рисунок 6: Моделирование остановки сердца, брадикардии и тахикардии у куколки D. melanogaster . (A) OCT изображение поперечного сечения тела куколки. Сердце выглядит как круг под поверхностью тела. (B) Графическое представление восстановительной остановки сердца. Верхняя панель показывает время (ось X) освещения красным светом (ось Y, процент уровня мощности источника света). Средняя панель показывает изменение площади сердца (ось Y, квадратные микрометры) с течением времени (ось X). Нижняя панель показывает изменение частоты сердечных сокращений (ось Y, герц) с течением времени (ось X). (C) Графическое представление eNpHR2.0-опосредованной восстановительной брадикардии. Верхняя панель показывает импульсы освещения красным светом, вызывающие два периода брадикардии: 50% RHR и 25% RHR. Средняя и нижняя панели показывают изменения области сердца и частоты сердечных сокращений соответственно. (D) Графическое представление кардиостимуляции активированным ReaChR. Верхняя панель показывает серию импульсов красного света 20 мс на частотах RHR + 0,5 Гц, RHR + 1 Гц и RHR + 1,5 Гц. Сердечные сокращения следуют частотам светового импульса, как показано на средней и нижней панелях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Дополнительный рисунок 1: Генетические скрещивания для замены хромосомы балансировщика TM3 Sb на TM6 Sb Tb. Девственные самки Hand-GAL4 w+/ TM3 Sb скрещивались с nub-GAL4NP3537 tub-GAL80ts w+/ TM6 Sb Tb самцами. Были отобраны hand-GAL4 w+/ TM6 Sb Tb потомство, включая девственных самок и самцов (скрининг пигментированных глаз в сочетании с пухлой формой тела). Отобранные мухи были самостоятельно скрещены, чтобы создать стабильный запас. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 2: В контрольных экспериментах сердечный ритм личинки дикого типа (wt) не изменяется при освещении красным светом. (A) Во время освещения красным светом у личинок не наблюдалось остановки сердца. На верхней панели отображаются изображения сердца в М-режиме. Красная линия указывает время освещения. Средняя и нижняя панели показывают область сердца и частоту сердечных сокращений в течение времени визуализации 32 с. (В,С) Импульсы красного света не изменяют частоту сердечных сокращений у личинок. На верхних панелях отображаются изображения сердца в М-режиме. Красная линия указывает время освещения. Средняя и нижняя панели показывают область сердца и частоту сердечных сокращений в течение времени визуализации 32 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 3: В контрольных экспериментах сердечный ритм куколки дикого типа (wt) не изменяется при освещении красным светом. (A) Во время освещения красным светом у личинок не наблюдалось остановки сердца. На верхней панели отображаются изображения сердца в М-режиме. Красная линия указывает время освещения. Средняя и нижняя панели показывают область сердца и частоту сердечных сокращений в течение времени визуализации 32 с. (В,С) Импульсы красного света не изменяют частоту сердечных сокращений в wt куколке. На верхних панелях отображаются изображения сердца в М-режиме. Красная линия указывает время освещения. Средняя и нижняя панели показывают область сердца и частоту сердечных сокращений в течение времени визуализации 32 с. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительный рисунок 4: Личинки d. melanogaster и куколки, экспрессирующие Hand>eNpHR2.0 или Hand>ReaChR , не показывают значительных изменений ЧСС во время визуализации ОКТ без освещения красным светом. (A) Частота сердечных сокращений личинки Hand>eNpHR2.0 . (B) Частота сердечных сокращений личинки Hand>ReaChR . (C) Частота сердечных сокращений у куколки Hand>eNpHR2.0 . (D) Частота сердечных сокращений куколки Hand>ReaChR . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл. Дополнительное видео 1: Активированный eNpHR2.0 вызывает остановку сердца у личинки D. melanogaster . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео. Дополнительное видео 2: Активированный eNpHR2.0 вызывает остановку сердца у куколки D. melanogaster . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео. Дополнительное видео 3: eNpHR2.0-опосредованная восстановительная брадикардия у личинки D. melanogaster . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео. Дополнительное видео 4: eNpHR2.0-опосредованная восстановительная брадикардия у куколки D. melanogaster . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео. Дополнительное видео 5: Кардиостимуляция активированным ReaChR у личинки D. melanogaster . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео. Дополнительное видео 6: Кардиостимуляция активированным ReaChR у куколки D. melanogaster . Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

Discussion

По сравнению с нашими предыдущими отчетами, где экспрессия опсинов была вызвана не только в сердце, но и в окружающих мышечных тканях, настоящая работа сообщает с использованием кардиоспецифического драйвера , Hand-GAL4. Эта новая генетическая конфигурация hand> opsin, используемая для оптогенетической регуляции сердца, еще раз подтверждает ранее сообщенные результаты и устанавливает лучшую модель сердечно-сосудистых исследований дрозофилы .

Подготовка сми имеет важное значение для успеха экспериментов. Белки опсина требуют лиганда, полностью транс-ретинального (ATR), чтобы функционировать28. Мухи не производят достаточно atr, поэтому ATR должен быть дополнен в среду полета. В этом исследовании ранее сообщенная пища быстрого приготовления была заменена полуопределенной средой29. Новая рецептура ATR-содержащих сред была введена для обеспечения равномерного распределения ATR. ATR не растворим в воде; когда запас ATR на основе этанола 100 мМ добавляется в среду на водной основе, он диспергируется путем вихря флаконов, содержащих теплые полуопределенные среды. Кроме того, ранее сообщенная концентрация ATR была снижена с 10 мМ для eNpHR2,0 и 3 мМ для ReaChR22 до конечной концентрации 1 мМ для обоих. Эта концентрация достаточна для обеспечения надлежащей функции eNpHR2.0 и ReaChR.

Жизненно важным компонентом экспериментального успеха является улучшенная обработка данных с помощью FlyNet 2.027. Лаборатория продолжает разрабатывать это программное обеспечение для повышения как вычислительной эффективности, так и точности автоматизированного алгоритма сегментации сердца мухи. Маски поперечного сечения, производимые этим программным обеспечением, используются для получения физиологических данных дрозофилы , таких как дробное укорочение и скорость сердечной стенки. Этот подход позволил эффективно анализировать данные с минимальным наблюдением человека, что позволяет быстрее и надежнее охарактеризовать функцию сердца для больших наборов данных визуализации сердца мух.

Инфаркт миокарда остается ведущей причиной смерти, а ишемия миокарда способствует двум третям всех случаев сердечной недостаточности, которая стремительно вырисовывается среди ведущих причин смертности и заболеваемости в США30. Разработка новых терапевтических средств и медицинских устройств требует глубоких знаний механизмов сердечных заболеваний на физиологическом и биохимическом уровнях. Эти цели могут быть достигнуты с помощью модельных организмов. D. melanogaster зарекомендовал себя как одна из самых надежных и эффективных моделей 31,32,33,34,35. Эта работа создала смоделированные модели сердечных расстройств дрозофилы, вызванные неинвазивным оптогенетическим подходом. Развитие неинвазивных оптических технологий кардиостимуляции обеспечивает основу для разработки альтернативы традиционным электрическим кардиостимуляторам. Использование OCT для наблюдения за функцией сердца в режиме реального времени позволяет исследованиям точно охарактеризовать соответствующую физиологию сердца в моделях дрозофилы для расширенных исследований, включая скрининг кандидатов на лекарства. OCT-визуализация имеет глубину проникновения ~ 1 мм, что хорошо работает для исследований сердца дрозофилы, но ограничивает ее использование для характеристики функции сердца на более крупных животных моделях. Кроме того, прямой перевод исследований дрозофилы на модели млекопитающих представляет собой проблему. Необходимо разработать новые оптогенетические инструменты для улучшения чувствительности к опсинам и перевода их в различные модельные системы, включая рыбок данио, мышей, крыс и органоидов сердца человека, для сердечно-сосудистых исследований.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы благодарят Андрея Комарова, Юйсюань Вана и Цзяньтао Чжу за помощь в анализе данных и благодарят членов лаборатории Чжоу за их ценные дискуссии. Работа в лаборатории доктора Чжоу поддерживалась стартовым фондом Вашингтонского университета в Сент-Луисе, грантами Национального института здравоохранения (NIH) R01-EB025209 и R01-HL156265, а также премией Clayco Foundation Innovative Research Award.

Materials

All-trans retinal Cayman Chemicals 18449
Bacto Peptone Gibco 02-10-2025
BioLED Light Source Control Module, 4-channel Migtex Systems BLS-SA04-US Part of the optogenetic stimulation module
Broadband Light Source Module Superlum cBLMD-T-850-HP Part of the SD-OCT imaging system
Cobra-S 800 OCT Spectrometers  Wasatch Photonics CS800-840/180-80-OC2K-U3 Part of the SD-OCT imaging system
Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professtional 34155 tissues
Drosophila agar Genesee Scientific 66-103
Drosophila culture bottles Genesee Scientific 32-131
FlyNet 2.0 Software Z-Lab Custom software for fly heart segmentation and heart function analysis developed in the Zhou lab
High-Power LED Collimator Sources Migtex Systems BLS-LCS-0617-03-22 Part of the optogenetic stimulation module
Inactive dry yeast Genesee Scientific 62-106
Microscope slides AmScope BS-72P
Narrow plugs for Drosophila culture Genesee Scientific 59-200
Narrow vials for Drosophila culture Genesee Scientific 32-116SB
Permanent double-sided tape Scotch
Plugs for Drosophila bottles Genesee Scientific 59-194
Propionic Acid Sigma P1386-1L
SD-OCT control software Z-Lab Custom software for image acquisition and pacing control developed in the Zhou lab
SD-OCT imaging and optogenetic pacing system Z-Lab Imaging and optogenetic pacing system developed in the Zhou lab (~$50k BOM)
Sucrose Carolina 89-2871
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-eNpHR-YFP}attP2 Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) stock # 41752 eNpHR2.0 transgenic line
w[*]; P{y[+t7.7] w[+mC]=UAS-ReaChR}su(Hw)attP5/CyO Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) stock # 53748 ReaChR transgenic line
w[1118]; P{y[+t7.7] w[+mC]=GMR88D05-GAL4}attP2/TM3 Sb[1] Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) stock # 48396 Heart specific GAL4 driver containing Hand gene regulatory fragment
y[*] w[*]; P{w[+mC]=UAS-2xEGFP}AH3 Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC) stock #6658 GFP reporter line
Yeast extract Lab Scientific bioKEMIX 978-907-4243
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Nature Methods. Method of the Year 2010. Nature Methods. 8, 1 (2011).
  2. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  3. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  4. Tsai, H. -. C. Phasic firing in dopaminergic neurons is sufficient for behavioral conditioning. Science. 324 (5930), 1080-1084 (2009).
  5. Wykes, R. C., et al. Optogenetic and potassium channel gene therapy in a rodent model of focal neocortical epilepsy. Science Translational Medicine. 4 (161), (2012).
  6. Entcheva, E., Kay, M. W. Cardiac optogenetics: a decade of enlightenment. Nature Reviews Cardiology. 18 (5), 349-367 (2021).
  7. Bruegmann, T., et al. Optogenetic control of heart muscle in vitro and in vivo. Nature Methods. 7 (11), 897-900 (2010).
  8. Arrenberg, A. B., Stainier, D. Y. R., Baier, H., Huisken, J. Optogenetic control of cardiac function. Science. 330 (6006), 971-974 (2010).
  9. Nussinovitch, U., Gepstein, L. Optogenetics for in vivo cardiac pacing and resynchronization therapies. Nature Biotechnology. 33 (7), 750-754 (2015).
  10. Nyns, E. C. A., et al. An automated hybrid bioelectronic system for autogenous restoration of sinus rhythm in atrial fibrillation. Science Translational Medicine. 11 (481), (2019).
  11. Bier, E., Bodmer, R. Drosophila, an emerging model for cardiac disease. Gene. 342 (1), 1-11 (2004).
  12. Wolf, M. J., Amrein, H., Izatt, J. A., Choma, M. A., Reedy, M. C., Rockman, H. A. Drosophila as a model for the identification of genes causing adult human heart disease. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (5), 1394-1399 (2006).
  13. Yu, L., Lee, T., Lin, N., Wolf, M. J. Affecting rhomboid-3 function causes a dilated heart in adult Drosophila. PLOS Genetics. 6 (5), 1000969 (2010).
  14. Cooper, A. S., Rymond, K. E., Ward, M. A., Bocook, E. L., Cooper, R. L. Monitoring heart function in larval Drosophila melanogaster for physiological studies. Journal of Visualized Experiments. (33), e1596 (2009).
  15. Zhu, Y. C., Yocom, E., Sifers, J., Uradu, H., Cooper, R. L. Modulatory effects on Drosophila larva hearts: Room temperature, acute and chronic cold stress. Journal of Comparative Physiology. B, Biochemical, Systemic, and Environmental Physiology. 186 (7), 829-841 (2016).
  16. Zhu, Y. C., Uradu, H., Majeed, Z. R., Cooper, R. L. Optogenetic stimulation of Drosophila heart rate at different temperatures and Ca2+ concentrations. Physiological Reports. 4 (3), 12695 (2016).
  17. Malloy, C., et al. Using optogenetics to assess neuroendocrine modulation of heart rate in Drosophila melanogaster larvae. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 203 (10), 791-806 (2017).
  18. Men, J., et al. Drosophila preparation and longitudinal imaging of heart function in vivo using optical coherence microscopy (OCM). Journal of Visualized Experiments. (118), e55002 (2016).
  19. Choma, M. A., Izatt, S. D., Wessells, R. J., Bodmer, R., Izatt, J. A. In vivo imaging of the adult Drosophila melanogaster heart with real-time optical coherence tomography. Circulation. 114 (2), 35-36 (2006).
  20. Li, A., et al. Changes in the expression of the Alzheimer’s disease-associated presenilin gene in drosophila heart leads to cardiac dysfunction. Current Alzheimer Research. 8 (3), 313-322 (2011).
  21. Li, A., et al. Silencing of the Drosophila ortholog of SOX5 in heart leads to cardiac dysfunction as detected by optical coherence tomography. Human Molecular Genetics. 22 (18), 3798-3806 (2013).
  22. Men, J., Li, A., Jerwick, J., Li, Z., Tanzi, R. E., Zhou, C. Non-invasive red-light optogenetic control of Drosophila cardiac function. Communications Biology. 3 (1), 1-10 (2020).
  23. Alex, A., Li, A., Tanzi, R. E., Zhou, C. Optogenetic pacing in Drosophila melanogaster. Science Advances. 1 (9), 1500639 (2015).
  24. Stanley, C. E., Mauss, A. S., Borst, A., Cooper, R. L. The effects of chloride flux on Drosophila heart rate. Methods and Protocols. 2 (3), 73 (2019).
  25. Lindsley, D. L., Zimm, G. G. . The Genome of Drosophila melanogaster. , (1992).
  26. . Bloomington Drosophila Stock Center Available from: https://bdsc.indiana.edu/information/recipes/germanfood.html (2022)
  27. Dong, Z., et al. FlyNet 2.0: Drosophila heart 3D (2D + time) segmentation in optical coherence microscopy images using a convolutional long short-term memory neural network. Biomedical Optics Express. 11 (3), 1568-1579 (2020).
  28. Deisseroth, K. Optogenetics. Nature Methods. 8 (1), 26-29 (2011).
  29. Backhaus, B., Sulkowski, E., Schlote, F. W. A semi-synthetic, general-purpose medium for Drosophila melanogaster. Drosophila Information Service. 60, 210-212 (1984).
  30. Benjamin, E. J., et al. Heart disease and stroke statistics-2019 update: A report from the American Heart Association. Circulation. 139 (10), 56 (2019).
  31. Wolf, M. J., Rockman, H. A. Drosophila, genetic screens, and cardiac function. Circulation Research. 109 (7), 794-806 (2011).
  32. Choma, M. A., Suter, M. J., Vakoc, B. J., Bouma, B. E., Tearney, G. J. Physiological homology between Drosophila melanogaster and vertebrate cardiovascular systems. Disease Models & Mechanisms. 4 (3), 411-420 (2011).
  33. Ocorr, K., Vogler, G., Bodmer, R. Methods to assess Drosophila heart development, function and aging. Methods [Supplement to Methods in Enzymology]. 68 (1), 265-272 (2014).
  34. Ugur, B., Chen, K., Bellen, H. J. Drosophila tools and assays for the study of human diseases. Disease Models & Mechanisms. 9 (3), 235-244 (2016).
  35. Rotstein, B., Paululat, A. On the morphology of the Drosophila heart. Journal of Cardiovascular Development and Disease. 3 (2), 15 (2016).

Tags

Keywords: Drosophila MelanogasterOptogenetic ControlCardiac FunctionOCT ImagingOptogenetic PacingHeart Disease ModelsNon-invasive ImagingHeart OrganoidsZebrafishEmbryonic Heart
check_url/pt/63939?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Gracheva, E., Wang, F., Matt, A., Liang, H., Fishman, M., Zhou, C. Developing Drosophila melanogaster Models for Imaging and Optogenetic Control of Cardiac Function. J. Vis. Exp. (186), e63939, doi:10.3791/63939 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image