Auto-immune encefalitis is een nieuwe categorie van antilichaam-gemedieerde ziekten van het centrale zenuwstelsel. Hippocampusneuronen kunnen worden gebruikt om deze antilichamen te ontdekken en te karakteriseren. Dit artikel biedt een protocol voor primaire celkweek en immunostaining om auto-antilichamen in het serum en cerebrospinale vloeistof van patiënten te bepalen.
In de afgelopen 15 jaar is een nieuwe categorie van antilichaamgemedieerde ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS) gekarakteriseerd en wordt nu gedefinieerd als “auto-immune encefalitis” (AE). Er zijn momenteel 17 bekende AE-syndromen en ze zijn allemaal geassocieerd met antilichamen tegen het neuronale celoppervlak of synaptische eiwitten. De klinische syndromen zijn complex en variëren afhankelijk van het type geassocieerd antilichaam. De bekendste van deze ziekten is anti-N-methyl D-aspartaatreceptor (NMDAR) encefalitis, een prominente neuropsychiatrische aandoening geassocieerd met ernstige geheugen- en gedragsstoornissen. De geassocieerde antilichamen reageren met de GluN1-subeenheid van de NMDAR op het N-terminale domein. De aanpak die het meest wordt gebruikt voor de ontdekking en karakterisering van AE-antilichamen omvat de cultuur van gedissocieerde, foetale, knaagdier hippocampale neuronen. Tijdens het proces van antilichaamkarakterisering worden levende neuronen in cultuur blootgesteld aan het serum of de liquor van patiënten, en de detectie van reactiviteit geeft aan dat het serum of de liquormonsters van de patiënt antilichamen bevatten tegen neuronale oppervlakteantigenen. Hippocampusculturen kunnen ook worden gebruikt om te bepalen of de antilichamen bij patiënten potentieel pathogeen zijn door te onderzoeken of ze structurele of functionele veranderingen van de neuronen veroorzaken. De mate van succes van deze studies hangt af van de kwaliteit van de culturen en van de protocollen die worden gebruikt om de reactiviteit van patiëntmonsters te verkrijgen en te detecteren. Dit artikel biedt een geoptimaliseerd protocol voor primaire celkweek van foetale rat hippocampus neuronen in combinatie met immunostaining om de aanwezigheid van antilichamen in het serum of csf van patiënten te bepalen. Een voorbeeld van hoe de potentiële pathogene effecten van NMDAR-antilichamen kunnen worden onderzocht met behulp van gekweekte neuronen en calciumbeeldvorming wordt ook gepresenteerd.
Auto-immune encefalitis (AE) is een recent ontdekte categorie ziekten van het centrale zenuwstelsel (CZS) gemedieerd door antilichamen die zich richten op neuronale oppervlakte- of synaptische eiwitten 1,2. De klinische kenmerken variëren afhankelijk van het antilichaam, maar omvatten gewoonlijk een verminderd geheugen en cognitie, veranderd gedrag en psychiatrische symptomen, abnormale bewegingen, slaapstoornissen, verminderd bewustzijnsniveau en epileptische aanvallen. Deze aandoeningen kunnen van invloed zijn op personen van alle leeftijden, waarbij sommige soorten LR voornamelijk kinderen en jonge volwassenen treffen2.
In de afgelopen 15 jaar zijn 17 AE-syndromen met antilichamen tegen specifieke neuronale oppervlakte-/synaptische eiwitten beschreven (tabel 1). Enkele voorbeelden van de neuronale doelwitten zijn de synaptische excitatorische receptoren NMDAR 3,4 en AMPAR5, de synaptische remmende receptor GABAbR6, het neuronale uitgescheiden eiwit LGI17 en het celadhesiemolecuul IgLON58. Voor de meeste van deze LR hebben studies aangetoond dat de antilichamen de structuur of functie van hun doelantigeen verstoren, waardoor een pathogene rol sterk wordt ondersteund. Bijvoorbeeld, bij anti-NMDAR encefalitis reageren de antilichamen met het N-terminale domein van de GluN1-subeenheid van de NMDAR, waardoor een selectieve en omkeerbare internalisatie van deze receptoren ontstaat die resulteert in prominente neuropsychiatrische veranderingen 4,9,10,11. De identificatie van een van de 17 bekende antilichamen in het serum of de liquor van een patiënt kan dus ook worden gebruikt als een diagnostische test die de diagnose van een specifieke LR vaststelt.
Een van de technieken die vaker worden gebruikt voor de identificatie en karakterisering van deze antilichamen omvat het gebruik van culturen van gedissocieerde, foetale, knaagdier hippocampus neuronen. Deze culturen zijn om verschillende redenen nuttig: embryonale hersenen zijn gemakkelijk te dissociëren en bevatten een laag niveau van gliacellen, de belangrijkste bron van besmetting in neuronale culturen12; de celpopulatie van de hippocampus is relatief homogeen in vergelijking met de meeste andere regio’s van het CZS, met piramidale cellen die de overgrote meerderheid13,14 vertegenwoordigen; culturen worden bereid uit embryo’s in een laat stadium wanneer de generatie van piramidale neuronen is voltooid, maar korrelcellen zich nog niet hebben ontwikkeld, wat verder bijdraagt aan de homogeniteit van de cultuur; wanneer gekweekt, piramidale neuronen drukken de meeste van hun belangrijkste fenotypische kenmerken uit, zijn in staat om goed ontwikkelde dendrieten te vormen en synaptisch verbonden netwerken tot stand te brengen die kunnen worden gebruikt voor structureel en elektrofysiologisch onderzoek12,13; aangezien antilichamen geen levende neuronen kunnen binnendringen, maakt het gebruik van levende culturen de identificatie mogelijk van antigene doelen die zich op het celoppervlak bevinden; en immunoprecipitatie van het antilichaam-antigeencomplex uit neuronale culturen maakt identificatie van het doelantigeen5 mogelijk.
Het succes van studies met neuronale culturen is sterk afhankelijk van de kwaliteit van de culturen en de protocollen die worden gebruikt om de immunoreactiviteit van het serum of cerebrospinale vloeistof (CSF) van een patiënt te beoordelen. Variabelen die de culturen kunnen beïnvloeden, zijn onder meer de procedures voor isolatie van de hippocampus voorafgaand aan de cultuurontwikkeling, de dissociatie van het weefsel, de platingdichtheid, het gebruikte groeioppervlak en de samenstelling van de media 13,15,16. Dit artikel biedt een geoptimaliseerd protocol voor primaire celkweek van foetale rat hippocampus neuronen in combinatie met fluorescerende immunostaining die kan worden gebruikt om de aanwezigheid van antilichamen tegen bekende AE-antigenen en mogelijk nieuwe oppervlaktedoelen te bepalen. Het biedt ook een voorbeeld van hoe de pathogene effecten van NMDAR-antilichamen kunnen worden onderzocht door live-cell imaging-technieken met behulp van gekweekte hippocampale neuronen die een genetisch gecodeerde calciumindicator (GECI) uit de GCaMP-familie, GCaMP5G, tot expressie brengen.
Doeleiwit | Eiwitfunctie | Celcompartiment | Hoofdsyndroom |
Nmdar | Ion Chanel | Synaptisch eiwit | Anti-NMDAR encefalitis |
Ampar | Ion Chanel | Synaptisch eiwit | Limbische encefalitis |
Gluk2 | Ion Chanel | Synaptisch eiwit | Encefalitis |
GABAaR | Ion Chanel | Synaptisch eiwit | Encefalitis |
GabAbr | Metabotrope receptor | Synaptisch eiwit | Limbische encefalitis |
mGluR1 | Metabotrope receptor | Synaptisch eiwit | Encefalitis |
mGluR2 | Metabotrope receptor | Synaptisch eiwit | Encefalitis |
mGluR5 | Metabotrope receptor | Synaptisch eiwit | Encefalitis |
D2R | Metabotrope receptor | Synaptisch eiwit | Basale ganglia-encefalitis |
LGI1 | Adhesie molecuul | Celoppervlak eiwit | Limbische encefalitis |
CASPR2 | Adhesie molecuul | Celoppervlak eiwit | Limbische encefalitis |
IgLON5 | Adhesie molecuul | Celoppervlak eiwit | Anti-IgLON5 ziekte |
Neurexin-3α | Adhesie molecuul | Celoppervlak eiwit | Encefalitis |
DNER (Tr) | Transmembraaneiwit | Celoppervlak eiwit | Encefalitis |
SEZ6L | Transmembraaneiwit | Celoppervlak eiwit | Encefalitis |
Amfifysine | Structureel molecuul | Celoppervlak eiwit | Limbische encefalitis |
DPPX | Peptidase | Celoppervlak eiwit | Encefalitis |
Tabel 1: Antilichamen tegen het neuronale celoppervlak en synaptische eiwitten.
Het groeiende veld van antilichaam-gemedieerde auto-immuniteit heeft een venster van mogelijkheden geopend voor de identificatie van neuronale auto-antilichamen die kunnen worden gebruikt om de diagnose en behandeling van patiënten te verbeteren. Culturen van hippocampusneuronen zijn een essentieel hulpmiddel voor de identificatie van antilichamen; daarom is het belangrijk om een gestandaardiseerd protocol uit te voeren om betrouwbare en reproduceerbare resultaten te verkrijgen. De belangrijkste stappen om te overwegen, beperkingen en probleemoplossing worden hier besproken.
De kritieke stappen van dit protocol kunnen worden gegroepeerd in drie categorieën, afhankelijk van of ze de zuiverheid, de homogeniteit of de levensvatbaarheid van de hippocampusneuronen beïnvloeden.
Zuiverheid – Om optimale primaire celculturen te verkrijgen, moet de onderzoeker zelfverzekerd, getraind en in staat zijn om snel te werken, vooral om de tijd van de dissectie te minimaliseren. Zelfs als piramidale neuronen het belangrijkste celtype zijn, bevat de hippocampus een verscheidenheid aan interneuronen14. Om culturen met minimale gliacellen te genereren, moet de hippocampus worden geëxtraheerd met het minimale omliggende weefsel. Het gebruik van een zwarte achtergrond tijdens de dissectie helpt om de grenzen van de hippocampus onder de stereomicroscoop te identificeren. Bovendien moet er rekening mee worden gehouden dat lagere celdichtheden resulteren in minder paracriene ondersteuning en het moeilijker maken om de cultuur te behouden13. Het is dus belangrijk om deze balans in gedachten te houden. Dit is belangrijk in beeldvormingsstudies die een laag aantal cellen gebruiken (50.000 neuronen per schotel van 3,5 cm). Om extra tijd te hebben voor de hippocampusextractie, moeten Hibernate-media worden gebruikt die het weefsel behouden17. Werken met adequate chirurgische hulpmiddelen is ook essentieel. Zeer nauwkeurige gereedschappen zijn delicaat, dus de reproduceerbaarheid van de techniek moet worden gewaarborgd door ze zorgvuldig te beschermen.
Homogeniteit – Om een cultuur zonder celaggregaten te ontwikkelen, is de mechanische celdissociatie opgewaardeerd door het gebruik van een voorgetrokken glazen pipet te combineren met een standaard pipet van 1.000 μL.
Levensvatbaarheid – In dit protocol werden geen antibiotica toegevoegd omdat ze de neuronale prikkelbaarheid beïnvloeden en de elektrofysiologische eigenschappen van de gekweekte neuronen veranderen18. Daarom is besmetting zeer waarschijnlijk als de hoogste normen van steriliteit niet worden gehandhaafd. Temperatuur is ook een belangrijke factor. Het weefsel koud houden tijdens de hippocampusisolatie vertraagt het metabolisme en vermindert de celafbraak. Het weefsel werd daarom op ijs gehouden tot het celdissociatieproces. Bovendien is het cruciaal om de juiste balans te vinden tijdens de enzymatische celdissociatie die de cellen uitsplitst zonder duidelijke cellyse. In dit protocol zijn de timings van incubatie met trypsine en de daaropvolgende wasstappen geoptimaliseerd om individuele cellen te verkrijgen met voldoende ruimte om de creatie van een geschikt neuronaal netwerk mogelijk te maken.
Kritische stappen worden ook gevonden in fluorescerende live immunostaining en calciumactiviteitsregistraties van de neuronale culturen. Om succesvolle live immunostaining uit te voeren voor het bepalen van de aanwezigheid van antilichamen tegen celoppervlakeiwitten in patiëntmonsters, moet men permeabilisatie van de cellen vermijden die de antilichamen toegang geven tot intracellulaire eiwitten. Bovendien moeten op basis van de titer van de antilichamen de incubatietijd en de verdunning van het monster dienovereenkomstig worden aangepast (zeer hoge titerantistoffen kunnen bijvoorbeeld achtergrondkleuring geven die het interpreteren van de resultaten moeilijk maakt). Bij het uitvoeren van de pathogeniciteitsbeoordeling van de auto-antilichamen met calciumbeeldvorming, moet men een medium gebruiken dat optimaal is voor cellulaire activiteitsmetingen (bijv. Mg2 + -onderdrukking in het kweekmedium is belangrijk voor goede prestaties). Bovendien moeten voor fluorescentiebeeldvorming media met pH-indicatoren zoals fenolrood worden vermeden omdat het een niet-specifiek achtergrondsignaal introduceert.
Er zijn twee belangrijke beperkingen van het gebruik van hippocampus neuronale culturen. Ten eerste moeten in vergelijking met stabiele cellijnen continu primaire culturen worden gegenereerd, en dit impliceert het gebruik van proefdieren regelmatig. Geïnduceerde pluripotente stamcellijnen (iPSC) zouden de noodzaak voor het gebruik van diermodellen kunnen vervangen, maar de differentiatieprotocollen voor iPSC zijn nog steeds niet optimaal. Ten tweede drukken neuronen afgeleid van iPSC niet de volledige spectra van oppervlakte-eiwitten uit en daarom impliceert de afwezigheid van reactiviteit, indien gebruikt, niet noodzakelijkerwijs de negativiteit van het monster19.
Er zijn drie methoden om te screenen op de aanwezigheid van auto-antilichamen in het serum of csf van patiënten waarvan wordt vermoed dat ze AE hebben: weefselgebaseerde assay (TBA) met behulp van hersenweefsel van ratten, celgebaseerde assay (CBA) met BEHULP VAN HEK-cellen getransfecteerd om neuronale eiwitten tot expressie te brengen, en de toepassing die hier wordt gerapporteerd met behulp van levende culturen van hippocampale neuronen19. Het belang van de gekweekte hippocampusneuronmethode ligt in het vermogen om reactiviteit te differentiëren met oppervlakte- en intracellulaire antigenen die niet gemakkelijk kunnen worden onderscheiden door TBA. Bovendien worden primaire neuronale culturen, in tegenstelling tot CBA in HEK-getransfecteerde cellen, niet beperkt door het repertoire van getransfecteerde eiwitten. Bovendien kunnen gekweekte hippocampusneuronen worden gebruikt om nieuwe antilichamen en hun doelantigenen te identificeren in combinatie met immunoprecipitatie en massaspectrometrie en daarom het spectrum van identificeerbare antilichamen verbreden. Ten slotte maakt het de beoordeling van de pathogene effecten van de auto-antilichamen mogelijk door middel van live beeldvormingsmethoden die veranderingen in cellulaire activiteit kunnen volgen. Kortom, de identificatie van nieuwe auto-antilichamen maakt het uiteindelijk mogelijk om specifieke immunotherapieën te starten om de resultaten voor patiënten te verbeteren.
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Merche Rivas, Maria Marsal, Gustavo Castro, Jordi Cortés, Alina Hirschmann en Angel Sandoval (ICFO-Institut de Ciències Fotòniques) en Mercedes Alba, Marija Radosevic, David Soto, Xavier Gasull, Mar Guasp en Lidia Sabater (IDIBAPS, Hospital Clínic, Universiteit van Barcelona) voor hun technische ondersteuning en voor het leveren van reagentia, en Josep Dalmau en Myrna R. Rosenfeld (IDIBAPS, Hospital Clínic, Universiteit van Barcelona) voor hun kritische beoordeling van het manuscript en mentorschap. Deze studie werd gefinancierd door Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) en medegefinancierd door de Europese Unie, FIS (PI20/00280, J.P.), Fundació CELLEX (P.L-A.); Ministerio de Economía y Competitividad – Severo Ochoa-programma voor Centres of Excellence in R&D (CEX2019-000910-S, P.L-A.); CERCA-programma en Laserlab-Europe (871124, P.L-A.); Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033, P.L-A.); en Fondo Social Europeo (PRE2020-095721, M.C.).
10 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-020 | |
12 mm round coverslips | Fisher | NC9708845 | |
20x NA 0.75 S Fluor air objective | Nikon | CFI Super Fluor 20X | |
3.5 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-90 | |
6 cm Cell culture dish | Nunc | 12-565-94 | |
B27 supplement | Gibco | 17504-044 | |
Beaker 100 mL | Pirex | – | |
Borax | Sigma-Aldrich | B9876 | |
Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | |
Curved forceps | FST | 11009-13 | |
D-Glucose | Sigma-Aldrich | D9434 | |
DMEM High Glucose (4.5 g/L), without L-Glutamine, without Phenol Red | Capricorn | DMEM-HXRXA | |
Female Wistar rat (18-days pregnant) | Janvier | – | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Biowest | S181B-500 | |
Fine-angled forceps | FST | 11251-35 | |
Fine-curved forceps | FST | 11272-30 | |
Fine-straight forceps | FST | 11251-23 | |
FITC filter cube | Nikon | Standard Series | |
Forceps | FST | 11000-12 | |
Goat anti-Human AF488 | Invitrogen | A11013 | |
HBSS | Capricorn | HBSS-1A | |
HEPES | Sigma-Aldrich | H3375 | |
Hibernate-E medium | Gibco | A12476-01 | |
Horse Serum (HS) | Thermofisher | 26050088 | |
Human anti-NMDAR antibody (CSF) | Patient Sample | – | |
Human anti-NMDAR antibody (Serum) | Patient Sample | – | |
ImageJ/Fiji | NIH | v1.50i | |
Inverted fluorescence microscope | Nikon | Eclipse TE2000-U | |
KCl | Sigma-Aldrich | 44675 | |
L-Glutamine | Biowest | X0550-100 | |
Mercury lamp | Nikon | C-HGFI | |
Microscope cell chamber | Custom-build | – | |
NaCl | Sigma-Aldrich | S9887 | |
NBQX | Tocris | 373 | |
Neurobasal without phenol red | Gibco | 12348-017 | |
NMDA | Sigma-Aldrich | M3262 | |
pAAV2-CAG-GCaMP5G | VectorBiolabs | – | |
Paraformaldehyde 4% | Thermo scientific | J199943-K2 | |
Penicillin-Streptomycin | Biowest | L0022-100 | |
Phosphate-Buffered Saline | Gibco | 10010023 | |
Poly-L-Lysine (PLL) | Peptide international | OKK-35056 | |
Polystyrene ice tray | – | – | re-used cap of a polysterene box |
Precision spring-scissors | FST | 15000-08 | |
ProLong Gold with DAPI (antifading mounting media) | Molecular Probes | P36941 | |
Scissors | FST | 14068-12 | |
Sodium pyruvate | Biowest | L0642-100 | |
Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
Surgery scissors | FST | 14081-09 | |
Trypsin 2.5% | Gibco | 15090046 | |
Water, sterile endotoxine free | Sigma-Aldrich | W3500 |