Análisis citométrico de flujo de biomarcadores para la detección de defectos funcionales en espermatozoides humanos
Summary
El presente protocolo proporciona una solución práctica que permite medir la apoptosis, el potencial de membrana mitocondrial y el daño al ADN en espermatozoides humanos con un solo citómetro.
Abstract
El análisis convencional de los parámetros seminales se utiliza ampliamente para evaluar la fertilidad masculina. Sin embargo, los estudios han encontrado que ~ 15% de los pacientes infértiles no muestran anomalías en los parámetros convencionales del semen. Se necesitan tecnologías adicionales para explicar la infertilidad idiopática y detectar defectos sutiles en los espermatozoides. Actualmente, los biomarcadores de la función de los espermatozoides, incluida la apoptosis de los espermatozoides, el potencial de membrana mitocondrial (MMP) y el daño en el ADN, revelan la fisiología de los espermatozoides a nivel molecular y son capaces de predecir la fertilidad masculina.
Con las técnicas de citometría de flujo (FCM), cada uno de estos marcadores se puede medir de forma rápida, exacta y precisa en muestras de semen humano, pero los costos de tiempo aumentan sustancialmente y los resultados podrían obstruirse si todos los biomarcadores deben analizarse con un solo citómetro. En este protocolo, después de la recolección e incubación inmediata a 37 °C para licuación, las muestras de semen se analizaron más a fondo para detectar la apoptosis de los espermatozoides mediante tinción con isotiocianato de anexina V-fluoresceína (FITC)/yoduro de propidio (PI). La MMP se marcó con una sonda de yoduro de 5,5′,6,6′-tetracloro-1,1′,3,3′-tetraetil-benzimidazolilcarbocianina (JC-1), y el daño en el ADN se evaluó mediante el ensayo de estructura de cromatina espermática (SCSA) con tinción de naranja de acridina (AO). Por lo tanto, el análisis citométrico de flujo de los marcadores de función espermática puede ser una herramienta práctica y fiable para el diagnóstico de la infertilidad y la evaluación de la función de los espermatozoides tanto en el laboratorio como en la cama.
Introduction
La infertilidad se ha convertido en un problema de salud pública, ya que la infertilidad masculina contribuye al 40-50% de todos los casos 1,2. Aunque el análisis convencional de la calidad del semen juega un papel importante en la determinación del potencial de fertilidad masculina, aproximadamente el 15% de los pacientes con infertilidad tienen parámetros normales de espermatozoides, como el recuento de espermatozoides, la motilidad y la morfología3. Además, los exámenes de esperma de rutina tienen poca repetibilidad, proporcionan información limitada sobre la función de los espermatozoides y no pueden dar una evaluación precisa de la fertilidad masculina ni reflejar los defectos sutiles de los espermatozoides. Se han desarrollado múltiples técnicas para evaluar la función de los espermatozoides, como el ensayo de hemizona (HZA), el ensayo de penetración de espermatozoides, la prueba de hinchazón hipoosmótica, la prueba de anticuerpos antiespermatozoides, pero estos métodos consumen mucho tiempo y son vulnerables a las influencias subjetivas de los operadores. Por lo tanto, es necesario desarrollar métodos rápidos y precisos para el análisis de la función de los espermatozoides.
FCM es una tecnología de análisis rápido de una sola célula desarrollada en la década de 1970, que se ha utilizado ampliamente en varios campos de la biología celular y la medicina. La FCM es una herramienta robusta para la evaluación de la función espermática que analiza los espermatozoides marcados con una sonda de fluorescencia específica4. Los espermatozoides pasan a través de láseres monocanal o multicanal, y la luz dispersa y la fluorescencia emitida son producidas por un rayo láser. La luz dispersa incluye la luz dispersa hacia adelante (FSC) y la luz dispersa lateral (SSC), que refleja el tamaño de la celda probada y la granularidad de la celda o la estructura interna. Estas señales son recogidas, visualizadas y analizadas por el sistema informático y, en consecuencia, se miden de forma rápida y precisa una serie de características de los espermatozoides. Por lo tanto, la FCM es una técnica rápida, objetiva, multidimensional y de alto rendimiento que ha ganado cada vez más atención en el campo del análisis de espermatozoides. La aplicación de FCM puede compensar las deficiencias de los métodos tradicionales y proporciona un nuevo enfoque para la detección de la estructura y función interna de los espermatozoides.
La apoptosis espermática está estrechamente relacionada con la fertilidad masculina5. La detección de la apoptosis espermática es un índice importante para evaluar la función de los espermatozoides a nivel molecular. La FCM es ampliamente reconocida como un método fiable y sensible para detectar la apoptosis de los espermatozoides mediante la tinción con anexina V-FITC/PI. El principio básico es que la fosfatidilserina (PS) se transfiere de la capa interna de la membrana celular a su capa externa en la etapa temprana de la apoptosis. La anexina V es una proteína fosfolípida dependiente de Ca2+ (generalmente marcada por FITC) que tiene una alta afinidad por la PS, por lo tanto, detecta la PS expuesta a la superficie externa de la membrana celular6. La necrosis y la apoptosis se pueden distinguir en combinación con la tinción de Pl. Por lo tanto, el método de doble tinción de anexina V-FITC/PI es ampliamente utilizado, ya que es rápido, sencillo y fácil de detectar diferentes espermatozoides apoptóticos.
Un espermatozoide maduro de mamífero contiene aproximadamente 72-80 mitocondrias7, lo que sugiere una razón biológica para la retención de las mitocondrias de los espermatozoides8. Se ha descubierto que las mitocondrias de los espermatozoides desempeñan un papel importante en el mantenimiento de la motilidad y la fertilidad de los espermatozoides. La tinción JC-1, que se puede utilizar como indicador de MMP en una variedad de tipos celulares, es uno de los fluorocromos más populares para la evaluación de la actividad mitocondrial de los espermatozoides10. JC-1 es un colorante catiónico que se acumula potencialmente dependiente en las mitocondrias. JC-1 tiene una emisión de fluorescencia máxima a 525 nm (verde) y forma agregados J 11 cuando se une a membranas con un alto potencial (ΔΨm, 80-100 mV), lo que resulta en un cambio en la emisión de fluorescencia a ~590 nm (naranja-rojo). En consecuencia, la despolarización mitocondrial de los espermatozoides está indicada por una disminución en la relación de intensidad de fluorescencia rojo/verde, y la FCM se puede utilizar para detectar los niveles de MMP en muestras de semen humano.
La metodología SCSA fue inventada por Evenson et al.12, y se considera una prueba precisa y repetible con datos únicos de doble parámetro (fluorescencia roja vs verde) en una escala de 1.024 × 1.024 canales 13. En los espermatozoides dañados, el ADN y las proteínas alteradas en los núcleos de los espermatozoides se marcan mediante AO, y las roturas de la hebra de ADN se miden mediante fluorescencia roja, mientras que las hebras dobles intactas emiten fluorescencia verde en FCM14. Hoy en día, se han desarrollado muchos métodos para estimar la integridad del ADN de los espermatozoides. Sin embargo, a diferencia de la SCSA, estos ensayos suelen requerir mucha mano de obra y carecen de la capacidad de diagnosticar la infertilidad masculina. Los resultados de la prueba SCSA se correlacionan significativamente con el embarazo y el aborto espontáneo del ADN humano, proporcionan evidencia convincente de que el SCSA puede ser útil en el análisis del semen humano y puede servir como una herramienta valiosa para los médicos de infertilidad15.
La integridad de la cromatina, la MMP y la apoptosis reflejan diferentes aspectos de la función de los espermatozoides y, por lo tanto, la combinación de estos biomarcadores puede proporcionar una visión más completa del estado de los espermatozoides. La FCM se puede utilizar para mediciones separadas de la integridad de la cromatina, MMP o apoptosis en muestras de semen humano. Aunque el costo de la FCM y el costo de los colorantes han limitado la amplia aplicación de estas técnicas en los laboratorios clínicos de salud reproductiva, se está aceptando su valor para la estimación de la fecundidad.
Sin embargo, dado que cada uno de los experimentos requiere un tratamiento previo de las muestras de espermatozoides, y todas las muestras pretratadas deben analizarse lo antes posible, la medición simultánea de los tres biomarcadores para una muestra con un solo FCM puede dar lugar a un largo tiempo de espera para algunos de los experimentos y obstruir la fiabilidad de los resultados. Esto se debe a que los espermatozoides reciben un daño adicional durante el proceso de espera, si el protocolo no se organiza correctamente teniendo en cuenta los tres experimentos. En este artículo se presenta un protocolo que permite la medición fluida de los tres biomarcadores en una sola citometría sin comprometer sustancialmente la calidad del experimento inducida por tiempos de espera prolongados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Se ha encontrado que la integridad de la cromatina, la MMP y la apoptosis de los espermatozoides humanos son valiosos predictores de los resultados reproductivos. El último manual de laboratorio de la OMS para el examen y procesamiento del semen humano (sexta edición) también destacó algunos de estos indicadores (integridad de la cromatina y apoptosis) como exámenes más amplios que van más allá del examen básico de parámetros rutinarios como el recuento de espermatozoides18. Publicaciones recientes también sugieren que estos indicadores pueden ser marcadores más sensibles de respuesta a exposiciones externas peligrosas, lo que indica su potencial para la identificación de daños reproductivos en una etapa más temprana19,20. La combinación de estos indicadores con exámenes rutinarios también puede proporcionar una comprensión más completa sobre el perfil de la disfunción espermática y la complejidad del daño reproductivo masculino en la población.
Hay varias cuestiones clave que determinan sustancialmente el éxito del análisis de espermatozoides con FCM. En primer lugar, la medición de la MMP y la apoptosis de los espermatozoides requiere un examen inmediato después de que se licúa el semen. Para minimizar el coste de tiempo, dos técnicos pueden encargarse por separado del pretratamiento de MMP y del análisis de apoptosis de una muestra. Como el pretratamiento de la apoptosis es más simple, se transferiría a la etapa de citometría de flujo más rápido que el análisis MMP. Para el análisis SCSA, las muestras de semen fresco deben criopreservarse inmediatamente después de la licuefacción. Las muestras de esperma pueden almacenarse en nitrógeno líquido durante un período relativamente largo y no necesitan un examen inmediato.
En consecuencia, el costo de tiempo in situ del experimento se puede comprimir a 40 minutos, que es la duración del análisis de MMP más el paso citométrico de flujo del análisis de espermatozoides. En segundo lugar, la configuración de la compuerta en la plataforma de citometría de flujo debe decidirse para cada lote de muestras por separado. Las muestras de espermatozoides con subgrupos de células claras en el diagrama de dispersión se pueden seleccionar como referencia para dibujar el área de compuerta. En tercer lugar, dado que no existen valores de referencia clínica ampliamente aceptados para los indicadores de este experimento, los resultados históricos pueden utilizarse como una herramienta importante para el control de calidad. También se recomienda establecer controles positivos y negativos en cada lote de mediciones, especialmente para SCSA y MMP.
Los resultados representativos del análisis de espermatozoides proporcionados aquí se derivan utilizando un Accuri C6. Sin embargo, la técnica podría aplicarse a otras plataformas comerciales con pequeñas modificaciones. Por lo general, se necesitaría un total de 5 × 106 espermatozoides para cumplir con el requisito de medición de todos los indicadores. Si la concentración de espermatozoides de una muestra es mucho más baja que el nivel medio, la necesidad del volumen de semen aumentaría.
Al igual que los parámetros rutinarios de los espermatozoides, también hay una variación intraindividual notable en la integridad de la cromatina, MMP y apoptosis de los espermatozoides humanos21. En consecuencia, múltiples pruebas de muestras recogidas en diferentes momentos pueden proporcionar una estimación más precisa del nivel de daño de la función espermática. Aunque no existe un período recomendado de abstinencia antes de la toma de muestras de espermatozoides para el análisis citométrico de flujo, se pueden adoptar de 2 a 7 días de abstinencia eyaculatoria, sugerido por la OMS para el análisis rutinario de espermatozoides. Puede ayudar a mejorar la comparabilidad de los resultados entre laboratorios y entre diferentes muestras recogidas de los mismos hombres.
Una limitación importante de este método es que dos de los tres biomarcadores probados, la apoptosis y el potencial de membrana mitocondrial, requieren muestras de semen fresco. Esto puede limitar su aplicación a los hombres que pueden proporcionar muestras de semen al laboratorio. Para la prueba de daño en el ADN (SCSA), se deben preparar muestras de referencia antes del experimento para calibrar el citómetro de flujo. Cabe destacar que la aplicación del protocolo actual requiere un instrumento de MCA en el laboratorio, lo que sigue siendo un desafío considerable para muchos laboratorios clínicos, aunque la cooperación con un servicio de terceros puede ser una opción alternativa en algunas regiones.
Además, el gasto de los tintes y otros reactivos también es un factor financiero para los hombres que pueden necesitar el examen. Por último, es posible que sea necesario modificar el protocolo si se utilizan diferentes marcas o versiones de FCM para examinar los biomarcadores. En resumen, este trabajo presenta un enfoque práctico para estimar tres biomarcadores de daño en espermatozoides humanos mediante una sola máquina de citometría de flujo. Esto puede proporcionar información valiosa sobre la salud reproductiva masculina y complementar el examen de esperma de rutina.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a todos los trabajadores de campo por su ayuda y a los entrevistados por su cooperación.
Materials
| 0.1 M citric acid buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | 251275-5G | Add 21.01 g/L citric acid monohydrate (FW = 210.14; 0.10 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 0.2 M Na2PO4 buffer | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | V900061-500G | Add 28.4 g sodium phosphate dibasic (FW = 141.96; 0.2 M) to 1.0 L H2O. Store up to several months at 4 °C. |
| 10 mM CCCP stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | C2759 | Add 20.46 mg CCCP to 10.0 mL DMSO,making up to the final of CCCP in a concentration of 10mM, aliquot and store at −80 °C. |
| 10 µM CCCP working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 10 μL CCCP stock solution, making up to the final of CCCP in a concentration of 10 µM. | ||
| 1 mM JC-1 stock solution | Sigma-Aldrich Chemical Co., USA | T4069 | JC-1 is purchased lyophilized. Add a small quantity of DMSO to the vial and vortex for several minutes until all the dye has dissolved. Transfer the solution to a light-tight tube and rinse the vial with appropriate volume of DMSO, making up to the final of JC-1 in a concentration of 1 mg/mL aliquot and store at −20 °C. |
| 37 °C incubator | Thermo Scientific, USA | ||
| 5 µM JC-1 working solution | Add 10 mL of PBS to a 15 mL polypropylene centrifuge tube and add 50 μL from a thawed JC-1 stock aliquot. Stir gently to assure a homogenous dilution. This solution must be stored in the dark and used promptly. | ||
| Accuri C6 Flow cytometer | BD Pharmingen, San Diego, CA, United States | ||
| Acid solution, pH 1.2 | Combine 20.0 mL of 2.0 N HCl (0.08 N), 4.39 g of NaCl (0.15 M), and 0.5 mL of Triton X-100 (0.1%) in H2O for a final volume of 500 mL. Adjust pH to 1.2 with 5 mol/L HCl. | ||
| Acridine Orange (AO) stock solution, 1.0 mg/mL | Polysciences, Inc, Warrington, Pa | 65-61-2 | Dissolve chromatographically purified AO in dd-H2O at 1.0 mg/mL. |
| AO staining solution (working solution) | Add 600 μL of AO stock solution to each 100 mL of staining buffer. | ||
| Biological safety hood | Airtech, USA | ||
| Computer-aided sperm analysis system (CASA ) | Microptic, Barcelona, Spain | Sperm Class Analyzer 5.3.00 | |
| Sperm Counting Chamber | Goldcyto, Spain | ||
| Equipments | |||
| FITC Annexin V Apoptosis Detection Kit I | BD Biosciences, San Jose, CA | 556547 | Included: (1) FITC Annexin V is bottled at 100 ng/µL; (2) Propidium Iodide (PI):The PI Staining Solution is composed of 50 µg PI/mL in PBS (pH 7.4) and is 0.2 µM sterile filtered; (3) 10x Binding Buffer: 0.1 M Hepes (pH 7.4), 1.4 M NaCl, 25 mM CaCl2. For a 1x working solution, dilute 1 part of the 10x Annexin V Binding Buffer to 9 parts of distilled water. Store at 4 °C and protected from prolonged exposure to light. Do not freeze. |
| FlowJo 10 | Tree Star, Inc., San Carlos, CA, USA | ||
| Horizontal centrifuge | Thermo Scientific, USA | ||
| liquid nitrogen tank | Thermolyne, USA | ||
| Materials | |||
| PBS | Beyotime, Shanghai, China | C0221A | Ready-to-use PBS buffers is purchased and stored at room temperature |
| Staining buffer, pH 6.0 | Combine 370 mL of 0.10 M citric acid buffer, 630 mL of 0.20 M Na2PO4 buffer, 372 mg of EDTA (disodium, FW = 372.24; 1 mM), and 8.77 g of NaC1 (0.15 M). Mix overnight on a stir plate to insure that the EDTA is entirely in solution. pH to 6.0 with saturated NaOH solution. | ||
| The reference sample for SCSA analysis | The reference sample was diluted with cold (4 °C) TNE buffer to a working concentration of 1–2 × 106 cells/mL, and used to set the green at 475/1,024 flow cytometry channels and set the red at 125/1,024 flow cytometry channels. | ||
| TNE buffer, 1x, pH 7.4 (working solution) | Combine 60 mL of 10x TNE and 540 mL of H2O. Check pH (7.4). | ||
| TNE buffer, 10x, pH 7.4 | Perfemiker, Shanghai, China | PM11733 | Ready-to-use buffers is purchased and stored at 4 °C. |
Referências
- Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. A unique view on male infertility around the globe. Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).
- Nachtigall, R. D. International disparities in access to infertility services. Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).
- Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come. Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).
- Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. New flow cytometry approaches in equine andrology. Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).
- Oosterhuis, G. J., et al. Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality. Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).
- Koopman, G., et al. Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis. Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).
- Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. Signaling mechanisms in mammalian sperm motility. Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).
- Lehti, M. S., Sironen, A. Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects. Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).
- Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction. Andrologia. 53 (1), 13666 (2021).
- Agnihotri, S. K., et al. Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility. In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).
- Smiley, S. T., et al. Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).
- Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility. Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).
- Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity. Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).
- Evenson, D. P. Sperm chromatin structure assay (SCSA®). Methods in Molecular Biology. 927, 147-164 (2013).
- Agarwal, A., Said, T. M. Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility. Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).
- Ricci, G. Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes. Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).
- Zhang, H. -. B., et al. Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation. Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).
- . WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen Available from: https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787 (2022)
- Evenson, D. P., Wixon, R. Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA). Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).
- Wang, Y. X., et al. Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China. Environmental Research. 150, 557-565 (2016).
- Ni, W., et al. Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments. Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).
