エチレンジアミン四酢酸媒介接着消によるフィーダー細胞上のヒト多能性幹細胞の迅速で費用対効果の高い酵素フリー継代

以下に記載するアッセイおよび比較では、2つのヒトES細胞株(それぞれWiCellおよびKarolinska InstituteのH9およびHS429)および2つのiPS細胞株(いずれもノルウェーのヒト多能性幹細胞コアファシリティによって作製されたNCS001およびNCS002)を使用しました。図と表のデータはヒトES細胞株のものですが、iPS細胞株でも全く同様の結果が得られました。 私たちの手では、機械的収穫により、コロニーは直径200~250μmの約5〜6個の塊に分割されましたが、EDTAによる接着解除とそれに続くトリチュレーションでは、各コロニーは直径~60μmの~10〜20個の塊に分割されました。EDTAで採取された各凝集塊の細胞数は~20と推定されます。メスでコロニーをこの大きさの塊に分割することは現実的ではないため、この点では、コロニー細胞の生存に有利なサイズの塊を生成するため、EDTAによる接着解除が優れています10,11。 また、EDTAを用いて採取したヒトES細胞/iPS細胞コロニーは、機械的に採取したコロニーと比較して、サイズと形状がより均一でした(図1A-F)。これは、機械的な収穫に必要な切断により、不均一なエッジとさまざまな塊のサイズが生成されるためです。これを定量的に評価するために、継代から5日後のコロニーの円形度(コロニーの縁がどれだけ丸みを帯びているかの尺度として、値1は真円を示す)をImageJ-win64プロトコル12を用いて評価した。コロニーの循環性は、機械的に収穫されたコロニーで有意に低かった(機械的収穫:0.61±0.10;EDTAベースの収穫:0.84±0.01;n = 10、p < 0.001、Mann-Whitney U検定、U = 10)。 コロニー形成中の収穫後の細胞間相互作用の尺度である、回収および再プレーティングされたコロニーの細胞密度は、EDTAベースの捕球および機械的捕球と同様でした(表1 および 図1G、H)。機械的に採取されたコロニーは、その中央領域で壊死を発症する傾向が大きかった(図1J)。これは、形状のばらつき、特に機械的に単離された細胞塊のサイズによるものと考えられますが、これらの塊が大きすぎると、新しい培養皿に移すときに簡単に折りたたまれてしまう可能性があります。これは、EDTAを使用して採取されたコロニーには当てはまらず、均一に半透明の外観を示し、エッジがはっきりとしていました(図1I)。 EDTAベースの収穫により、井戸に確立されたほぼすべてのコロニーを2〜3分以内に収集することができました。機械収穫では、すべてのコロニーを井戸に集めるのは面倒で時間がかかります。通常、機械収穫を使用して、~30%、または~20-25個のコロニーしか収集できず、これには~20分かかりました。同様に、コラゲナーゼ消化とそれに続く穏やかな掻き取りでは、すべてのコロニーを採取することは通常困難でしたが、全体の手順は数分しかかかりませんでした。したがって、EDTAベースの収穫は、酵素捕獲と同等または高速であり、機械的または酵素的収穫よりも効率的です。 異なる採取方法が幹細胞性および多能性に及ぼす影響を評価するために、まず、EDTAベースまたは機械的捕捉を用いて20継代後に得られたコロニーをqPCR分析(図2)および免疫細胞化学染色(図3 および 図4)にかけ、幹細胞マーカーについて調査しました。いずれの方法でも得られたコロニーは、mRNAレベルとタンパク質レベルの両方でステムネスマーカーの安定した発現を示しました。次に、胚様体の3つの胚葉層への分化により多能性を評価しました(図5 および 図6)。いずれかの方法で20回継代した後に得られたヒトES細胞またはiPS細胞から作製された胚様体には、外胚葉、中胚葉、および内胚葉について一般的に評価されるマーカーを発現する細胞の混合物が含まれていました。 最後に、qPCRベースの遺伝子解析を用いて、それぞれの方法で継代されたヒトES細胞およびヒトiPS細胞におけるゲノム異常の発生率を評価しました( 資料表参照)。いずれの採取法を用いても20継代後に得られたコロニーは、参照二倍体染色体パターンからわずかに逸脱した例がいくつか見られました(評価された異常は、ヒトiPS細胞のリプログラミングに一般的に関連する異常でしたが、ヒトES細胞でも得られます)(図7)。しかし、これらの偏差のパターンは、どちらの収穫方法の後に得られたコロニーでも本質的に同じであり、収穫方法に関連していないことを示しています。 図1:EDTAベースまたは機械的ハーベスティング後のコロニーの形態と細胞密度。 (A-F)(A-C)EDTAベースまたは(D-F)メカニカルハーベスティングを用いて、フィーダーフリー培養で20継代後5日間確立したH9 hESCコロニーの代表的な明視野画像。(G,H)(G)EDTAベースまたは(H)メカニカルハーベスティングを使用して20継代後に確立されたH9 hESCコロニーの細胞密度の代表的な蛍光画像。細胞核をDAPIで染色します。(I,J)(I)EDTAベースまたは(J)メカニカルハーベスティングを使用して20継代後に確立されたH9 hESCコロニーの代表的な明視野画像。機械的に採取されたコロニーの壊死した中央領域に注目してください(Jの矢印)。すべての画像は、20回目の通過から5日後に取得されました。スケールバー = 100 μm。略語:hESC =ヒト胚性幹細胞;EDTA =エチレンジアミン四酢酸;DAPI = 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図2:EDTAベースまたはメカニカルハーベスティング後に生成された2つのヒトES細胞株(H9およびHS429)における幹細胞マーカーmRNAの発現。 H9(上段)およびHS429(下段)のhESCにおいて、機械的ハーベスティングを使用した1回の継代後、メカニカルハーベスティングを使用した20継代後、およびEDTAベースのハーベスティング(1:5希釈)を使用した20継代後の、示されたマーカーの定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応。発現レベルは、ハウスキーピング遺伝子 ACTB (β-アクチン)の発現レベルに相対的です。エラーバーは標準偏差を示します。略語:hESC =ヒト胚性幹細胞;EDTA = エチレンジアミン四酢酸。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図3:異なる採取条件後のH9 hESC株におけるステムネスマーカータンパク質の発現。 H9 hESCコロニーの代表的な免疫蛍光染色は、さらなる継代前(A-E)、機械的捕捉を使用した20継代後(F-J)、およびEDTAベースの捕捉を使用した20継代後(K-O)のものです。スケールバー = 100 μm。略語:hESC =ヒト胚性幹細胞;EDTA =エチレンジアミン四酢酸;DAPI = 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図4:HS429 hESC株における異なる採取条件後の幹細胞マーカータンパク質の発現。 HS429 ヒトES細胞コロニーの代表的な免疫蛍光染色は、さらなる継代前(A-E)、機械的捕捉(F-J)機械的捕捉(20 継代後)、および(K-O)EDTA ベースの捕獲(20 継代後)です。スケールバー = 100 μm。略語:hESC =ヒト胚性幹細胞;EDTA =エチレンジアミン四酢酸;DAPI = 4′,6-ジアミジノ-2-フェニルインドール。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図5:機械的またはEDTAベースの採取後にH9 hESC系統から生成された胚様体中の3つの胚葉のマーカーの発現。 (A列およびD列)外胚葉(ECTO、TUJI)、(B列およびE列)内胚葉(ENDO、AFP)、および(C列およびF列)中胚葉(MESO、SMA)の代表的な免疫蛍光染色。(A-C)は20回の機械的捕獲後に、または(D-F)は20回のEDTAベースの捕集後に生成されました。スケールバー = 40 μm。略語:hESC =ヒト胚性幹細胞;EDTA =エチレンジアミン四酢酸;EBs = 胚様体。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図6:機械的またはEDTAベースの採取後にHS429 hESC株から生成された胚様体の3つの胚葉のマーカーの発現。 (A列およびD列)外胚葉(ECTO、TUJI)、(B列およびE列)内胚葉(ENDO、AFP)、および(C列およびF列)中胚葉(MESO、SMA)の代表的な免疫蛍光染色。20 回の機械的ハーベスティング (A-C) 後に生成された EB (A-C) または 20 回の EDTA ベースのハーベスティングの後に生成された EB (D-F)。スケールバー = 40 μm。略語:hESC =ヒト胚性幹細胞;EDTA =エチレンジアミン四酢酸;EBs = 胚様体。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 図7:HS9およびHS429 ESC株およびNCS002 iPS細胞株における一般的なゲノム異常のqPCRベースの遺伝子解析を、機械的またはEDTAベースのハーベスティングを用いて20継代後に 実施しました。値 2 のベースラインは、すべての染色体マーカーで正常な二倍体を表します。値 1 または 3 は、すべての細胞で示された染色体マーカーの損失または増加をそれぞれ表します。1 と 2 の間または 2 と 3 の間の中間値は、セルの一部に示されたマーカーの損失または増加が存在することを示します。収差のパターンは、2つの収穫条件で類似していることに注意してください。略語:ESC =胚性幹細胞;EDTA =エチレンジアミン四酢酸;iPS細胞=人工多能性幹細胞。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。 細胞密度(cells/mm2) H9の 意味する 標準偏差 さらなる継代前の機械的収穫 3918 263.3 機械収穫20回 3868 197.7 EDTA収穫20回 4080 127.8 HS429の 意味する 標準偏差 さらなる継代前の機械的収穫 5249 565.4 機械収穫20回 5247 726.3 EDTA収穫20回 4963 448.8 表1:EDTAベースまたは機械的採取後に生成された2つのヒトES細胞株(H9およびHS429)からのコロニーの細胞密度の比較。 細胞密度は、機械的捕捉を使用した1回の継代後、機械的捕捉を使用した20継代後、またはEDTAベースの捕球を使用した20継代後(1:5希釈)のいずれかで評価しました。いずれの場合も、n = 5コロニーである。