Detta protokoll beskriver studien av neutrofil-biofilminteraktioner. Staphylococcus aureus biofilmer etableras in vitro och inkuberas med perifera blod-härledda humana neutrofiler. Det oxidativa sprängresponsen från neutrofiler kvantifieras och neutrofillokaliseringen i biofilmen bestäms genom mikroskopi.
Neutrofiler är den första försvarslinjen som används av immunsystemet under mikrobiell infektion. In vivo rekryteras neutrofiler till infektionsstället där de använder processer som fagocytos, produktion av reaktiva syre- och kvävearter (ROS, RNS, respektive), NETosis (neutrofil extracellulär fälla) och degranulering för att döda mikrober och lösa infektionen. Interaktioner mellan neutrofiler och planktoniska mikrober har studerats omfattande. Det har funnits ett växande intresse för att studera infektioner orsakade av biofilmer de senaste åren. Biofilmer uppvisar egenskaper, inklusive tolerans mot dödande av neutrofiler, som skiljer sig från deras planktoniskt odlade motsvarigheter. Med den framgångsrika etableringen av både in vitro – och in vivo-biofilmmodeller kan interaktioner mellan dessa mikrobiella samhällen med olika immunceller nu undersökas. Här skräddarsys tekniker som använder en kombination av traditionella biofilmmodeller och väletablerade neutrofilaktivitetsanalyser specifikt för att studera neutrofil- och biofilminteraktioner. Bredfältfluorescensmikroskopi används för att övervaka lokaliseringen av neutrofiler i biofilmer. Dessa biofilmer odlas under statiska förhållanden, följt av tillsats av neutrofiler härledda från humant perifert blod. Proverna färgas med lämpliga färgämnen före visualisering under mikroskopet. Dessutom kvantifieras produktionen av ROS, som är en av de många neutrofila svaren mot patogener, i närvaro av en biofilm. Tillägget av immunceller till detta etablerade system kommer att utöka förståelsen för värd-patogeninteraktioner samtidigt som man säkerställer användningen av standardiserade och optimerade förhållanden för att mäta dessa processer exakt.
En biofilm är en gemenskap av ytassocierade mikrober eller icke-bundna aggregat inneslutna i en extracellulär polymer substans (EPS)1,2. Dessa samhällen skyddar de inneslutna mikroorganismerna från miljöstressorer, inklusive tolerans mot antimikrobiella medel och immunsystemet3. Flera patogena mikrobiella arter bildar biofilmer som har associerats med kroniska infektioner4. Utvecklingen av biofilmer är en invecklad process som involverar fastsättning på ytor, EPS-produktion, cellproliferation, biofilmstrukturering och cellavskiljning5. När celler har spridit sig för att bilda en biofilm förblir de planktoniska eller translokerar till ett nytt substrat och återinitierar biofilmutveckling6.
Staphylococcus aureus, en opportunistisk patogen, följer ett allmänt schema för biofilmutveckling, inklusive bindning, spridning, mognad och spridning7. Fästprocessen i S. aureus-biofilmer dikteras av hydrofoba interaktioner, teikosyror och mikrobiella ytkomponenter som känner igen adhesiva matrismolekyler (MSCRAMM)8,9. När spridningen av S. aureus börjar produceras EPS, som huvudsakligen består av polysackarider, proteiner, extracellulärt DNA och teikosyror,5. När EPS-komponenter produceras produceras också olika exoenzymer och små molekyler, vilket bidrar till biofilmens 3-dimensionella struktur och hjälper till att lossa5. S. aureus utnyttjar denna mycket samordnade livsstil för att etablera olika kroniska infektioner, inklusive infektioner på grund av att medicintekniska produkter finns i hemmet10.
Meticillinresistent S. aureus (MRSA) är en av de främsta orsakerna till infektioner relaterade till medicintekniska produkter i bostad, såsom centrala ven- och urinkatetrar, protesleder, pacemakers, mekaniska hjärtklaffar och intrauterina enheter11. Under sådana infektioner är neutrofiler de första värdimmuncellerna som rekryteras till infektionsstället för att bekämpa patogener via flera strategier12. Dessa inkluderar fagocytos, degranulering, reaktiv syre- och kväveart (ROS / RNS) produktion eller frisättning av neutrofila extracellulära fällor (NET) för att eliminera patogener13.
Generering av ROS vid fagocytos av mikrober är ett av de viktigaste antimikrobiella svaren som uppvisas av neutrofiler14. Fagocytos förbättras om mikrober är belagda med opsoniner, särskilt immunglobuliner och komplementkomponenter som finns i serum15. De opsoniserade mikroberna känns sedan igen av cellytereceptorer på neutrofiler och uppslukas och bildar ett fack som kallas fagosom15. Neutrofiler genererar och frisätter ROS i fagosomen via det membranassocierade NADPH-oxidaset16. Detta flerkomponentenzymkomplex genererar superoxidanjoner genom att överföra elektroner till molekylärt syre16. Dessutom genererar neutrofiler också RNS genom uttrycket av inducerbart kväveoxidsyntas (iNOS)17. Dessa höga superoxid- och kväveoxidradikaler inom fagosomen har breda antimikrobiella aktiviteter. De kan interagera med metallcentra i enzymer och skada nukleinsyror, proteiner och cellmembran i patogenen 18,19,20,21. Många mikrober antar en biofilmlivsstil och använder olika strategier för att undvika dödande av ROS22,23. Således är standardiserade analyser som kopplar biofilmer med neutrofiler för att kvantifiera ROS fördelaktiga för konsekventa resultat.
Medan analyser, såsom kvantifiering av neutrofil ROS-produktion, ger information om neutrofilernas svar på biofilmer, kan förmågan att visualisera interaktionerna mellan neutrofiler i en biofilm också fungera som ett kraftfullt verktyg. Användningen av fluorescerande färgämnen för mikroskopi kräver ofta optimering för att få högkvalitativa bilder som kan användas för mikroskopibildanalys. Flexibiliteten att optimera vissa tillstånd är begränsad eftersom neutrofiler kan genomgå celldöd efter isolering. Dessutom tvättas biofilmer vanligtvis för att avlägsna planktonpopulationen från den experimentella uppsättningen före tillsats av neutrofiler. Under tvättning kan variationer mellan replikatbiofilmer uppstå på grund av förlust av partiell biomassa om biofilmer fästs löst på ytan.
I stort sett inkluderar nuvarande metoder inom området för att analysera interaktioner mellan neutrofiler och biofilmer huvudsakligen mikroskopi, flödescytometri och kolonibildande enheter (CFU) uppräkning24,25,26,27. Mikroskopi innebär användning av färgämnen som antingen direkt fläckar neutrofilerna och biofilmerna, eller riktar olika neutrofilsvar mot mikrober såsom NET-bildning, degranulering och celldöd25,28. En delmängd av dessa svar, såsom neutrofil celldöd och degranulering, kan också analyseras via flödescytometri, men kräver att neutrofiler företrädesvis inte associeras med stora mikrobaggregat i en biofilm28,29. Flödescytometri kan också kvantifiera vissa biofilmparametrar, såsom cellviabilitet27. Dessa processer kräver dock störningar i biofilmbiomassan och skulle inte vara användbara för att visualisera andra viktiga interaktioner såsom den rumsliga fördelningen av neutrofiler och deras komponenter i en biofilm27,29,30.
Detta protokoll fokuserar på att anpassa några av de traditionellt använda metoderna för att studera neutrofil-biofilminteraktioner på biofilmer som har optimerats för att ge minimal variation under hantering. Detta protokoll tillhandahåller således standardiserade metoder för att odla och kvantifiera biofilmer, isolera primära humana neutrofiler från perifert blod, kvantifiera ROS-produktion och visualisera biofilm-neutrofilinteraktioner via mikroskopi. Detta protokoll kan anpassas till olika system för att förstå biofilm-neutrofila interaktioner samtidigt som man överväger heterogeniteten bland givarpooler.
Det har gjorts många ansträngningar för att odla robusta och reproducerbara S. aureus-biofilmer för nedströms experiment in vitro48,49,50. Ett standardiserat protokoll beskrivs som utnyttjar PLL: s katjoniska natur, samt kompletterar mediet med glukos för tillväxt av robusta in vitro S. aureus-biofilmer. Tillsatsen av PLL möjliggör bättre fastsättning av den negativt laddade bakteriecellen till de positivt laddade PLL-belagda ytorna. Det är viktigt att notera att PLL vid en koncentration på 10 μg/ml har antimikrobiell aktivitet mot Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli och S. aureus när den inkuberas i 24 timmar51. Samma koncentration används för att belägga ytor; emellertid aspireras överskott av PLL, vilket gör koncentrationen av PLL lägre än 10 μg / ml vid sådd för biofilmtillväxt.
Det är viktigt att notera att PLL endast har fungerat i specifika tillväxtmedier som MEMα med 2% glukos, där det observerades att S. aureus producerade robusta biofilmer med minimal variabilitet (Figur 2A). PLL-koncentration som ska användas tillsammans med andra medietyper skulle kräva ytterligare optimering, såsom att använda en ökad koncentration av PLL för att belägga brunnarna. Dessutom har dessa förhållanden optimerats för en monospecies S. aureus biofilm. Medan kroniska sårbiofilmer ofta är polymikrobiella, är standardisering av analyser för att studera monospecies biofilm och dess interaktioner med neutrofiler och andra immunceller nyckeln till att förstå deras bidrag till patogenes52. Dessa standardiserade protokoll kan optimeras ytterligare för att upprätthålla och studera polymikrobiella biofilmer och deras interaktioner med neutrofiler.
Det observerades också att rika bakterieodlingsmedier, såsom TSB, ledde till förlust av neutrofil livskraft (figur 1). Därför optimerades tillväxtförhållandena för S. aureus-biofilmer i MEMα, som används för däggdjurscellkulturer. För studier med neutrofiler, Detta media stöder neutrofil livskraft och främjar S. aureus tillväxt. Medan det observerades att media påverkar neutrofilernas livskraft, är det också viktigt att överväga att neutrofiler isolerade från perifert humant blod genomgår apoptos ex vivo med cirka 70% apoptotiska neutrofiler vid 20 h53. Detta kräver korrekt hantering, såsom att lagra neutrofilerna på is när man förbereder sig för experiment, använder endotoxinfria reagenser och förhindrar aktivering av neutrofiler genom att undvika virvelbildning av prover med neutrofiler.
Bedömningen av oxidativ burst i neutrofiler utförs rutinmässigt för att bestämma neutrofilernas dödande effekt på patogenen14,54,55. Dessa studier utförs ofta med planktoniska bakterier där neutrofiler tillsätts, och det oxidativa sprängresponsen kvantifieras med hjälp av luminolförstärkt kemiluminescens som detekterar superoxidanjoner som produceras av neutrofiler. Detta protokoll modifieras genom att ersätta planktoniska bakterier med statiskt odlad 18 h S. aureus biofilm. Som sådan kan neutrofiler tillsättas direkt till biofilmen för att bedöma deras aktivering. Å andra sidan producerar bakterier i biofilmer enzymer, såsom katalas och superoxiddismutas för att avgifta ROS23,56. Staphylococcus epidermidis biofilmer producerar högre katalas än dess planktoniska motsvarighet under stress57. Den totala kemiluminescensen av PMA-stimulerade neutrofiler i en S. aureus-biofilm är signifikant lägre än de PMA-stimulerade neutrofilerna där biofilm saknas (figur 2). Detta kan bero på aktiviteten hos dessa avgiftande enzymer. Dessutom producerar S. aureus biofilmer flera porbildande toxiner som kallas leukocidiner som dödar neutrofiler58. Det minskade burst-svaret beror sannolikt också på den minskade livskraften hos neutrofiler i närvaro av S. aureus biofilm. Medan denna studie använder luminol som detekterar den totala ROS som produceras både inuti och utanför cellerna, måste andra reagenser, såsom CM-H 2 DCFDA (5-(och-6) -klormetyl-2’7′-diklordihydrofluoresceindiacetat) eller isoluminol, övervägas om målet med arbetet är att studera intracellulär eller extracellulär ROS-produktion14,53,54 specifikt.
Förmågan att visualisera neutrofil-biofilminteraktioner via mikroskopi kan vara informativ om beteendet hos neutrofiler och biofilmer i närvaro av varandra. Excitations- och emissionsspektra för fluorescerande färgämnen och proteiner representerar en ögonblicksbild av interaktionen mellan en 18 h S. aureus biofilm och neutrofiler efter en 30 minuters inkubation. För att effektivt fånga signaler från färgade celler är det viktigt att begränsa provernas exponering för ljuskällor medan du ställer in proverna för mikroskopi. Under avbildning undviks snabb fotoblekning av proverna genom att sänka ljuskällans intensitet vid justering av alla parametrar som Z-stackhöjd och exponeringstid för olika kanaler.
Dessa enkla metoder möjliggjorde korrekt mikroskopiavbildning där det observerades att få neutrofiler är lokaliserade i biofilmen (figur 4A). Detta kan bero på utrymmen som finns i biofilmen eftersom 18 h S. aureus biofilm odlad i MEMα med 2% glukos inte täcker ytan jämnt (figur 4B). Andra studiers användning av rika medier har dock visat en enhetlig gräsmatta av S. aureus biofilmtillväxt och leukocyter som tränger igenom biofilmen30,58. Vidare observeras också att det fanns neutrofil celldöd efter 30 minuters inkubation med S. aureus-biofilmer på grund av S. aureus biofilmproducerade leukocidiner som lyser neutrofiler58 (Figur 4A,D). Tillsats av ett tvättsteg för att avlägsna icke-vidhäftade neutrofiler efter inkubation av dem med biofilm i 30 minuter avlägsnade ~ 15% av döda neutrofiler från systemet jämfört med den otvättade gruppen, i vilken mikroskopi utfördes omedelbart efter 30 minuters inkubation (figur 4D). Neutrofiler som interagerar med S. aureus observerades också (figur 4C). Ytterligare experiment krävs för att bedöma om S. aureus är uppslukad av neutrofiler eller fäst vid cellytan hos neutrofiler54. Avbildning av neutrofiler och biofilmer är det första steget för att utvärdera flera neutrofila funktioner nedströms, såsom fagocytos och NETosis54,59. Effekten av neutrofiler på biofilmer kan också bedömas genom att kvantifiera biofilmbiomassan, strukturella förändringar av biofilmen och biofilmens livskraft, bland många andra, med hjälp av bildanalysverktyg som anges i steg 5.6. Slutligen finns variationer mellan givare i neutrofiler; Därför rekommenderas att minst tre olika givare används för studier med neutrofiler.
Sammantaget kombinerades standardiserade in vitro-analyser för att bedöma interaktioner mellan neutrofiler och biofilmer. Även om dessa analyser använder S. aureus, kan de beskrivna protokollen enkelt anpassas för att studera andra patogener. Även om det finns olika in vivo-modeller för att studera värd-patogeninteraktioner, kan de vara dyra och arbetsintensiva, särskilt om förhållandena inte är optimerade. Att arbeta med standardiserade in vitro-analyser gör att man kan optimera experimentella förhållanden och bekräfta observationer innan man flyttar till ett in vivo-system. Slutligen har olika djurinfektionsmodeller använts för att studera biofilm-neutrofila interaktioner in vivo. Det är dock viktigt att överväga immunologiska skillnader mellan människor och djurmodeller60,61,62,63. Detta kräver att man använder neutrofiler som härrör från människor för att studera dessa komplexa värd-patogeninteraktioner.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av National Institute of Allergy and Infectious Diseases (R01AI077628) till DJW och ett American Heart Association Career Development Award (19CDA34630005) till ESG. Vi tackar Dr. Paul Stoodley för att förse oss med USA 300 LAC GFP-stam. Dessutom erkänner vi resurser från Campus Microscopy and Imaging Facility (CMIF) och OSU Comprehensive Cancer Center (OSUCCC) Microscopy Shared Resource (MSR), Ohio State University. Vi tackar också Amelia Staats, Peter Burback och Lisa Coleman från Stoodley-labbet för att de utförde bloddragningar.
0.9% sodium chloride irrigation, USP | Baxter | 2F7124 | Endotoxin-free; Used for isolation of neutrophils |
150 mL rapid-flow filter unit | Thermo Scientific | 565-0020 | |
200 proof ethanol | VWR | 89125-188 | |
3 mL syringe | BD | 309657 | Used for blood draw |
50 mL conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | |
60 mL syringe | BD | 309653 | Used for blood draw |
Agar | Fisher Bioreagents | BP1423-2 | |
Alcohol swab | BD | Used for blood draw | |
Band-aids | Used for blood draw | ||
BD Bacto Tryptic Soy Broth | BD | DF0370-07-5 | Combine with 1.5% agar to make Tryptic Soy Agar |
Cell counter | Bal Saupply | 202C | |
CellTracker blue CMCH | Invitrogen | C2111 | Blue CMAC Dye (BCD) |
Clear bottom 96-well flat bottom polystyrene plates | Costar | 3370 | |
Cotton gauze | Fisherbrand | 13-761-52 | Used for blood draw |
Crystal violet | Acros Organic | 40583-0250 | |
Culture tubes | Fisherbrand | 14-961-27 | Borosilicate Glass 13 x 100 mm |
D-(+)-glucose | Sigma | G-8270 | |
Dextran from Leuconostoc spp. | Sigma | 31392-250G | Used for isolation of neutrophils |
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS) 1x | Gibco | 14190-144 | |
Ethidium homodimer-1 | Invitrogen | L3224 B | |
Ficoll-Paque plus | Cytiva | 17144003 | Used for isolation of neutrophils (density gradient medium) |
Hanks' balanced salt solution (HBSS) 1x | Corning cellgro | 21-022-CV | without calcium, magnesium, and phenol red |
Hemacytometer | Bright Line | ||
Heparin | Novaplus | NDC 63323-540-57 | 1000 USP units/mL, Used for blood draw |
IMARIS 9.8 | Oxford Instruments | Microscopy image analysis software | |
Luminol | Sigma | A8511-5G | |
Minimal essential media (MEM) Alpha 1x | Gibco | 41061-029 | |
Needle (23 G1) | BD | 305145 | Used for blood draw |
Nikon Eclipse Ti2 | Nikon | ||
NIS-Elements | Nikon | Quantification of dead neutrophils | |
Normal human serum | Complement Technology | NHS | |
Petri Dish (100 x 15 mm) | VWR | 25384-342 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | |||
Poly-L-lysine solution | Sigma | P4707-50ML | |
Sodium chloride | Fisher Bioreagents | BP358-10 | Used for neutrophil isolation |
SoftMax Pro Software | Molecular Devices | Microplate reader software used for data acquisition | |
SpectraMax i3x | Molecular Devices | Microplate reader | |
Sterile water for irrigation, USP | Baxter | 2F7114 | Endotoxin-free; Used for neutrophil isolation |
Surflo winged infusion set | Terumo | SC*19BLK | 19 G x 3/4", used for blood draw |
Trypan blue stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | |
Turnicate | Used for blood draw | ||
UltraPure distilled water | Invitrogen | 10977015 | |
White opaque 96-well plates | Falcon | 353296 | Tissue culture treated and flat bottom plate |
μ-Slide VI 0.4 | Ibidi | 80601 | μ-channel slide |