Светоиндуцированная электронная микроскопия in situ transmission для наблюдения взаимодействия жидкости и мягкой материи

Световые явления в высоком разрешении интересны во многих областях, таких как наноинженерия ^1,2,3, катализ ^4,5 и биофотоника 6. Некоторые оригинальные конструкции, позволяющие проводить подобные эксперименты, можно найти в литературе, в том числе модификации образцов держателей ^1,4,7,8,9 и оптического волокна, прикрепленного к микроскопу ^10,11.

Сочетание светового освещения, жидкой среды и просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ) дает прекрасную возможность для детальных, динамических исследований фотоиндуцированных процессов. Однако состояние высокого вакуума внутри микроскопа довольно неблагоприятно для многих жидкостей, особенно водных растворов. Жидкая инкапсуляция, которая защищает его от окружающей среды, может быть достигнута с использованием нескольких методов, основанных главным образом на графене¹², нитриде кремния¹³ или подложках углерода¹⁴. В дополнение к исследованиям в области материаловедения², так называемые жидкие клетки предлагают возможности для проведения нетрадиционных микроскопических наблюдений за биологическими образцами вблизи их^{родных условий 15}. Такие наблюдения чрезвычайно требовательны, особенно для живых микроорганизмов, таких как бактериальные клетки. Электронный пучок как ионизирующее излучение вызывает необратимые повреждения гидратированных образцов, поэтому доза электронов должна быть указана¹⁶. Это необходимо, чтобы минимизировать неблагоприятные последствия, контролировать ущерб и избегать путаницы артефактов. Оптимальная максимальная доза электронов, которая позволяет наблюдать за живыми клетками, по-прежнему является сомнительной темой¹⁶, но доза 30 e−/нм², ^{по-видимому}, является пороговым значением, по крайней мере, для бактерий¹⁷.

Некоторые из предметов, представляющих интерес для таких микроскопических исследований, являются процессами во время антимикробной фотодинамической терапии (APDT)¹⁸. Короче говоря, терапия протекает следующим образом. Бактериальные клетки окружены светочувствительной жидкостью, называемой фотосенсибилизатором. Когда световое освещение дается на определенной длине волны, цитотоксические активные формы кислорода (АФК) генерируются из энергии или передачи заряда от возбужденных молекул фотосенсибилизатора к кислороду, естественно присутствующему в растворе. Патогены, подвергшиеся воздействию АФК, быстро инактивируются с очень высокой эффективностью, без побочных эффектов¹⁹. Реакция на терапию варьируется для разных микробов – например, воздействие одного и того же фотосенсибилизатора может быть совершенно разным для грамположительных и грамотрицательных бактерий²⁰. В целом установлено, что основной мишенью АФК являются внешние структуры клеток, где повреждение приводит к функциональным нарушениям клеточной мембраны и, следовательно, приводит к гибели^{бактерий 21,22}. Однако повреждение нуклеиновых кислот и белков также может считаться причиной инактивации¹⁸, поэтому до сих пор неизвестно, какие клеточные структуры являются основными мишенями во время этого процесса¹⁹. Более глубокое понимание разрушительных процессов может помочь улучшить эту окончательную терапию. По сравнению с методами световой микроскопии, используемыми в исследовании APDT²³, методы TEM дают больше возможностей для изучения механизма APDT с более высоким разрешением и увеличением²⁴. ТЭМ уже успешно используется для наблюдения за клетками во время проводимой терапии, что позволило детально изучить грамположительные повреждения бактерий и подробно описать изменения, происходящие внутри клеточной стенки ^6,25.

Текущий протокол представляет собой подходящую экспериментальную установку для визуализации с высоким разрешением инактивации светоиндуцированных бактерий с использованием ТЭМ, что требует надлежащей системы освещения света, инкапсуляции клеток жидкостью и строгого контроля дозы электронов. Бактериями, использованными для наблюдения, был золотистый стафилококк, а в качестве фотосенсибилизатора использовался раствор метиленового синего. Специальная установка светового освещения содержит перестраиваемый полупроводниковый лазер, подключенный непосредственно к колонке микроскопа с помощью светового волокна. Такая конструкция обеспечивает равномерное облучение по всему образцу из-за почти параллельного размещения оптического волокна к оси микроскопа. Монохроматический свет высокой интенсивности, генерируемый лазером, затем может быть использован для изучения различных фотохимических эффектов. Свет, используемый в эксперименте, имел длину волны, равную 660 нм, потому что в видимой области метиленовый синий имеет пики поглощения при 613 нм и 664 нм²⁶. Протокол инкапсуляции жидкости основан на углеродных субстратах, что делает процедуру быстрой и несложной. Наконец, представлен метод наблюдения за клетками в жидкости в низких дозах IN situ TEM. Обсуждаются трудности, связанные с подготовкой образца, воздействием дозы электронов на чувствительный образец и разумной интерпретацией изображения.