用于高通量低温电子显微镜的可控厚度微图案芯片的制备
Summary
通过应用微机电系统技术制造了新开发的具有氧化石墨烯窗口的微图案芯片，实现了各种生物分子和纳米材料的高效和高通量低温电子显微镜成像。
Abstract
使用低温电子显微镜（cryo-EM）对生物分子进行高效和高通量结构分析的一个主要限制是难以制备具有纳米级冰厚度控制的冷冻-EM样品。硅（Si）基芯片具有规则的微孔阵列，氧化石墨烯（GO）窗口图案化在厚度可控氮化硅（SixNy）薄膜上，是通过应用微机电系统（MEMS）技术开发的。采用紫外光刻、化学气相沉积、薄膜干湿蚀刻、二维纳米片材料滴铸等手段，大规模生产了带有GO窗口的微图案芯片。微孔的深度被调节以根据需要控制冰层厚度，具体取决于用于冷冻电镜分析的试样的大小。GO对生物分子的有利亲和力在冷冻-EM样品制备过程中将感兴趣的生物分子集中在微孔内。带有GO窗口的微图案芯片可实现各种生物分子以及无机纳米材料的高通量冷冻电镜成像。
Introduction
低温电子显微镜（cryo-EM）已被开发用于解析蛋白质在其天然状态下的三维（3D）结构1，2，3，4。该技术涉及将蛋白质固定在玻璃体冰的薄层（10-100nm）中，并使用透射电子显微镜（TEM）获取随机定向蛋白质的投影图像，并将样品保持在液氮温度下。获取数千到数百万张投影图像，并通过计算算法5，6用于重建蛋白质的3D结构。为了使用冷冻电镜进行成功分析，冷冻样品制备已经通过对控制印迹条件、湿度和温度的设备进行一次冷冻而实现了自动化。将样品溶液加载到具有孔碳膜的TEM网格上，依次吸墨以除去多余的溶液，然后用液体乙烷暴冻以产生薄的玻璃体冰1，5，6。随着冷冻电镜的进步和样品制备7的自动化，冷冻电镜越来越多地用于解决蛋白质的结构，包括病毒包膜蛋白和细胞膜中的离子通道蛋白8，9，10。致病性病毒颗粒的包膜蛋白结构对于了解病毒感染病理学以及开发诊断系统和疫苗（例如导致COVID-19大流行的SARS-CoV-2 11）非常重要。此外，冷冻电镜技术最近已应用于材料科学，例如用于对电池12，13，14和催化系统14，15中使用的光束敏感材料进行成像，以及分析溶液态16中无机材料的结构。
尽管冷冻电镜和相关技术有了明显的发展，但冷冻样品制备存在局限性，阻碍了高通量3D结构分析。制备具有最佳厚度的玻璃体冰膜对于获得具有原子分辨率的生物材料的3D结构尤为重要。冰必须足够薄，以尽量减少被冰散射的电子的背景噪声，并禁止沿电子束路径1，17的生物分子重叠。然而，如果冰太薄，它会导致蛋白质分子以优选的方向排列或变性18，19，20。因此，玻璃体冰的厚度应根据目标材料的尺寸进行优化。此外，通常需要花费大量精力来制备样品，并在制备的TEM网格上手动筛选冰和蛋白质的完整性。这个过程非常耗时，这阻碍了其高通量3D结构分析的效率。因此，提高冷冻电镜样品制备的可靠性和再现性将提高冷冻电镜在结构生物学和商业药物发现以及材料科学中的利用率。
在这里，我们介绍了用于制造具有氧化石墨烯（GO）窗口的微图案芯片的微加工工艺，该窗口设计用于具有受控冰厚度21的高通量冷冻电镜。微图案芯片是使用微机电系统（MEMS）技术制造的，该技术可以根据成像目的操纵芯片的结构和尺寸。带有GO窗口的微图案芯片具有微孔结构，可以填充样品溶液，并且可以调节微孔的深度以控制玻璃体的冰的厚度。GO对生物分子的强亲和力增强了生物分子的浓度，用于可视化，提高了结构分析的效率。此外，微图案芯片由Si框架组成，为网格19提供高机械稳定性，使其成为在样品制备程序和冷冻电镜成像期间处理芯片的理想选择。因此，通过MEMS技术制造的带有GO窗口的微图案芯片为冷冻电镜样品制备提供了可靠性和再现性，从而实现基于冷冻电镜的高效和高通量结构分析。
Protocol
Representative Results
Discussion
这里介绍了用于生产带有GO窗口的微图案芯片的微加工工艺。制造的微图案芯片旨在通过根据要分析的材料的大小，通过GO窗口控制微孔的深度来调节玻璃体冰层的厚度。使用一系列MEMS技术和2D纳米片转移方法制造了具有GO窗口的微图案芯片（图1）。使用MEMS制造技术的主要优点是其大规模生产能力，以及在光刻过程中使用不同设计的铬掩模来操纵微芯片结构和尺寸的可行性?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
医学硕士、高级硕士、法学硕士和日本特许厅感谢基础科学研究所的财政支持（资助号：10099）。伊巴斯-R006-D1）。S.K.，M.L.和J.P.感谢首尔国立大学（2021年）的创造性先锋研究人员计划的财政支持以及韩国政府资助的NRF赠款（MSIT;授权号NRF-2020R1A2C2101871 和 NRF-2021M3A9I4022936）。M.L.和J.P.感谢浦项制铁TJ公园基金会浦项制铁科学奖学金的财政支持和韩国政府资助的NRF赠款（MSIT;授予编号NRF-2017R1A5A1015365）。J.P.感谢韩国政府资助的NRF赠款的财政支持（MSIT;授予编号NRF-2020R1A6C101A183），以及首尔国立大学工程学院和医学院的跨学科研究计划（2021）。M.-H.K.感谢由韩国政府资助的NRF赠款的财政支持（MSIT;授予编号NRF-2020R1I1A1A0107416612）。作者感谢首尔大学高分子和细胞成像中心（SNU CMCI）的工作人员和工作人员对冷冻电镜实验的不懈努力和坚持不懈。作者感谢国家大学间研究设施中心的S.J.Kim对FIB-SEM实验的帮助。
Materials
| 1-methyl-2-pyrrolidinone (NMP) | Sigma Aldrich, USA | 443778 | |
| Acetone | |||
| AFM | Park Systems, South Korea | NX-10 | |
| Aligner | Midas System, South Korea | MDA-600S | |
| AZ 300 MIF developer | AZ Electronic Materials USA Corp., USA | 184411 | |
| Cryo-EM holder | Gatan, USA | 626 single tilt cryo-EM holder | |
| Cryo-plunging machine | Thermo Fisher SCIENTIFIC, USA | Vitrobot Mark IV | |
| Focused ion beam-scanning electron microscopy (FIB-SEM) | FEI Company, USA | Helios NanoLab 650 | |
| Glow discharger | Ted Pella Inc., USA | PELCO easiGlow | |
| Graphene oxide (GO) solution | Sigma Aldrich, USA | 763705 | |
| Hexamethyldisizazne (HMDS), 98+% | Alfa Aesar, USA | 10226590 | |
| Low pressure chemical vapor deposition (LPCVD) | Centrotherm, Germany | LPCVD E1200 | |
| maP1205 positive PR | Micro resist technology, Germany | A15139 | |
| Potassium hydroxide (KOH), flake | DAEJUNG CHEMICALS & METALS Co. LTD., South Korea | 6597-4400 | |
| Raman Spectrometer | NOST, South Korea | Confocal Micro Raman System HEDA | |
| Reactive ion etcher (RIE) | Scientific Engineering, South Korea | Lab-built | |
| SEM | Carl Zeiss, Germany | SUPRA 55VP | |
| Si wafer | JP COMMERCE, South Korea | 4" Silicon wafer, P(B)type, (100), 1-30ohm.c m, DSP, T:100um | |
| Spin coater | Dong Ah Trade Corp., South Korea | ACE-200 | |
| TEM | JEOL, Japan | JEM-2100F |
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