Tortricidae कीट कीटों में बड़े पैमाने पर पालन और आणविक अध्ययन
Summary
वर्तमान प्रोटोकॉल प्रयोगशालाओं में टॉट्रिसिड कीट कीटों के पालन की विधि का वर्णन करता है। कीटों के लिंग को अलग करने और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण के लिए न्यूक्लिक एसिड निकालने की प्रक्रियाओं को दो टॉट्रिसिड कीटों का उपयोग करके स्थापित किया जाता है।
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), जिसे आमतौर पर tortrix या leafroller पतंगों के रूप में जाना जाता है, में कई कृषि और वानिकी कीट शामिल हैं, जो गंभीर कृषि नुकसान का कारण बनते हैं। इस तरह के कीट पतंगों के जीव विज्ञान को समझने के लिए, मौलिक तकनीकों की उच्च मांग रही है। यहां, बड़े पैमाने पर पालन- पोषण, अवलोकन और आणविक अध्ययन के लिए विधियां दो चाय टॉर्ट्रिक्स, होमोना मैग्नानिमा और एडोक्सोफाइज होनमाई (लेपिडोप्टेरा: टॉर्ट्रिसिडी) का उपयोग करके विकसित की जाती हैं। कीटों को कटा हुआ कृत्रिम आहार के साथ बड़े पैमाने पर पाला जाता था और उनकी जैविक विशेषताओं पर विचार करके 100 से अधिक पीढ़ियों तक इनब्रीडिंग द्वारा बनाए रखा जाता था। कीटों में विभिन्न सेक्स द्विरूपताएं होती हैं; इसलिए विकासशील चरणों के दौरान सेक्स को अलग करना मुश्किल है, जिसने बाद के assays को रोका है। वर्तमान कार्य ने इस बात पर प्रकाश डाला कि टॉर्ट्रिसिड लार्वा के लिंग को महिला-विशिष्ट डब्ल्यू गुणसूत्र की कल्पना करने के लिए वृषण या लैक्टिक-एसिटिक ऑर्सीन स्टेनिंग को देखकर निर्धारित किया जा सकता है। इसके अलावा, लिंग निर्धारण विधियों का उपयोग करते हुए, वर्तमान अध्ययन ने लिंग निर्धारित भ्रूण से न्यूक्लिक एसिड निष्कर्षण और उच्च थ्रूपुट अनुक्रमण की ओर आवेदन को सक्षम किया। ये युक्तियाँ अन्य कीट कीटों के लिए लागू होती हैं और आगे के रूपात्मक और आनुवंशिक अध्ययन की सुविधा प्रदान करेंगी।
Introduction
लेपिडोप्टेरन कीड़े सभी वर्णित जीवित प्रजातियों के 10% से अधिक का प्रतिनिधित्व करते हैं, और कुछ टैक्सा प्रजातियां पौधों को गंभीर नुकसान पहुंचाती हैं और गंभीर कृषि नुकसान 2,3। यद्यपि आणविक और आनुवांशिक अध्ययन मॉडल कीड़ों का उपयोग करके विकसित किए गए हैं जैसे कि रेशम कीट बॉम्बिक्स मोरी 4,5, कीट कीड़े अनपेक्षित रहते हैं, आंशिक रूप से 6,7 के पालन और हैंडलिंग के लिए कठिनाइयों के कारण। इसलिए, ऐसे गैर-मॉडल कीट कीटों के जीव विज्ञान को समझने के लिए मौलिक अध्ययन और तकनीकें आवश्यक हैं।
Tortricidae (Lepidoptera), जिसे आमतौर पर tortrix या leafroller पतंगों के रूप में जाना जाता है, में कई कृषि और वानिकी कीटशामिल हैं। कीट टैक्सा में से, ओरिएंटल चाय tortrix Homona magnanima Diakonoff और गर्मियों के फल tortrix Adoxophyes honmai Yasuda गंभीर polyphagous कीट हैं जो पूर्वी एशिया7 में चाय के पेड़ों को नुकसान पहुंचाने के लिए जाने जाते हैं। दो प्रजातियां फ्लैट और अंडाकार पैमाने जैसे अंडे समूहों (या अंडे के द्रव्यमान) को रखती हैं, जिसमें मातृ स्राव द्वारा कवर किए गए पतले, नरम और नाजुक अंडे होते हैं। यद्यपि भ्रूणजनन चरण कीट विकास और लिंग निर्धारण9 के लिए महत्वपूर्ण हैं, अंडे की संरचनाएं कीटों के जीव विज्ञान को समझने से आगे के विश्लेषण को रोकती हैं। इस तरह के जटिल अंडे द्रव्यमान को रोकने वाले कीटों पर आगे के अध्ययन के लिए कठिनाइयों को दूर करना महत्वपूर्ण है।
यहां, टॉर्ट्रिसिड के जीव विज्ञान को समझने के लिए, बड़े पैमाने पर पालन, टिप्पणियों और आणविक अध्ययनों के लिए विधियों को ए होनमाई और एच मैग्नानिमा का उपयोग करके विकसित किया गया है। सबसे पहले, बड़े पैमाने पर पालन करने के तरीके इनब्रीड द्वारा 100 पीढ़ियों से अधिक टॉट्रिसिड दोनों को बनाए रखते हैं। concatenated पैमाने की तरह अंडे द्रव्यमान से अंडे के अलगाव ने पहले मक्खियों में उपयोग की जाने वाली तकनीकों से विकसित क्षारीय और कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग करके टॉर्ट्रिसिड के भ्रूणजनन अवलोकन की सुविधा प्रदानकी। इसके अलावा, वर्तमान अध्ययन ने लैक्टिक-एसिटिक ऑर्सीन11 का उपयोग करके लेपिडोप्टेरन मादाओं के सेक्स क्रोमैटिन के धुंधला तरीकों को विकसित करके छोटे भ्रूण के लिंग भेदभाव की स्थापना की। इन विधियों के संयोजन से, उच्च गुणवत्ता और मात्रा न्यूक्लिक एसिड को लिंग निर्धारित भ्रूण से निकाला गया था, जो अन्यथा स्थापित करना मुश्किल था6। निकाले गए आरएनए का उपयोग अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए किया गया था। सामूहिक रूप से, यहां प्रस्तुत विधियां अन्य लेपिडोप्टेरन कीड़ों और अन्य कीट टैक्सा पर लागू होती हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
टॉरट्रिसिड में कई कृषि और वानिकी कीट शामिल हैं; वर्तमान अध्ययन ने पीढ़ियों से टॉरट्रिक्स को पीछे करने, भ्रूणजनन और कीड़ों के लिंग का निरीक्षण करने और परिपक्व भ्रूण का उपयोग करके आणविक विश्लेषण करने के…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक युवा वैज्ञानिकों के लिए जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस (जेएसपीएस) रिसर्च फैलोशिप [अनुदान संख्या 19J13123 और 21J00895] से समर्थन को स्वीकार करना चाहते हैं।
Materials
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
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| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
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| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
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