Massenaufzucht und molekulare Studien an Tortricidae-Schädlingen
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Aufzuchtmethode von tortriciden Schädlingsinsekten in den Laboratorien. Die Verfahren zur Unterscheidung des Geschlechts von Insekten und zum Extrahieren von Nukleinsäuren für die Hochdurchsatzsequenzierung werden unter Verwendung von zwei Tortricid-Schädlingen festgelegt.
Abstract
Tortricidae (Lepidoptera), allgemein bekannt als Tortrix oder Blattwickler, umfassen viele land- und forstwirtschaftliche Schädlinge, die schwere landwirtschaftliche Verluste verursachen. Um die Biologie solcher Schädlingsmotten zu verstehen, waren grundlegende Techniken sehr gefragt. Hier werden Methoden zur Massenaufzucht, Beobachtungen und molekulare Studien mit zwei Teetortrix, Homona magnanima und Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae), entwickelt. Insekten wurden mit in Scheiben geschnittener künstlicher Nahrung massenhaft gezüchtet und durch Inzucht über 100 Generationen unter Berücksichtigung ihrer biologischen Eigenschaften aufrechterhalten. Insekten haben verschiedene Geschlechtsdimorphismen; Daher ist es schwierig, das Geschlecht während der Entwicklungsstadien zu unterscheiden, die nachfolgende Assays verhindert haben. Die vorliegende Arbeit hob hervor, dass das Geschlecht von Tortricidenlarven durch die Beobachtung von Hoden oder Milch-Essigsäure-Orcein-Färbung bestimmt werden konnte, um das frauenspezifische W-Chromosom zu visualisieren. Darüber hinaus ermöglichte die vorliegende Studie unter Verwendung der Geschlechtsbestimmungsmethoden Nukleinsäureextraktionen aus geschlechtsbestimmten Embryonen und die Anwendung auf Hochdurchsatzsequenzierung. Diese Tipps sind für andere Schadinsekten anwendbar und erleichtern weitere morphologische und genetische Studien.
Introduction
Lepidoptera-Insekten machen mehr als 10% aller beschriebenen lebenden Artenaus 1, und bestimmte Taxaarten verursachen schwere Schäden an Pflanzen und schwere landwirtschaftliche Verluste 2,3. Obwohl molekulare und genetische Studien mit Modellinsekten wie der Seidenraupe Bombyx mori4,5 entwickelt wurden, bleiben Schädlingsinsekten unerforscht, teilweise wegen der Schwierigkeiten bei der Aufzucht und Handhabung 6,7. Daher sind grundlegende Studien und Techniken notwendig, um die Biologie solcher Nicht-Modell-Schädlingsinsekten zu verstehen.
Die Tortricidae (Lepidoptera), allgemein bekannt als Tortrix oder Blattwickler, umfassen viele land- und forstwirtschaftliche Schädlinge8. Von den Insektentaxa sind die orientalische Teetortrix Homona magnanima Diakonoff und die Sommerfruchttortrix Adoxophyes honmai Yasuda schwere polyphage Schädlinge, von denen bekannt ist, dass sie Teebäume in Ostasien schädigen7. Die beiden Arten legen flache und ovale schuppenartige Eierhaufen (oder Eiermassen), die aus dünnen, weichen und zerbrechlichen Eiern bestehen, die von mütterlichen Sekreten bedeckt sind. Obwohl Embryogenesestadien für die Insektenentwicklung und die Geschlechtsbestimmung entscheidend sind9, verhindern Strukturen der Eier, dass weitere Analysen die Biologie der Insekten verstehen. Es ist wichtig, die Schwierigkeiten für weitere Studien über Schädlinge, die eine solche komplexe Eimasse ovipositieren, zu überwinden.
Um die Biologie der Tortricide zu verstehen, wurden Methoden zur Massenaufzucht, Beobachtungen und molekularen Studien mit A. honmai und H. magnanima entwickelt. Erstens erhalten Massenaufzuchtmethoden beide Tortrizide über 100 Generationen nach Inzucht. Die Trennung der Eier von der verketteten, schuppenartigen Eimasse erleichterte die embryonale Beobachtung der Tortricide mit alkalischen und organischen Lösungsmitteln, die zuvor aus Techniken entwickelt wurden, die bei Fliegen10 verwendet wurden. Darüber hinaus stellte die vorliegende Studie die geschlechtsspezifische Diskriminierung kleiner Embryonen fest, indem sie Färbemethoden für das Geschlechtschromatin von Lepidoptera-Weibchen unter Verwendung von Milch-Essig-Orcein11 entwickelte. Durch die Kombination dieser Methoden wurden qualitativ hochwertige und quantitative Nukleinsäuren aus geschlechtsbestimmten Embryonen extrahiert, was ansonsten schwer zu etablieren war6. Die extrahierte RNA wurde für die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet. Insgesamt gelten die hier vorgestellten Methoden für andere Lepidoptera-Insekten und andere Insektentaxa.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tortricid umfasst mehrere land- und forstwirtschaftliche Schädlinge; Die vorliegende Studie präsentierte Methoden zur Aufzucht von Tortrix über Generationen, zur Beobachtung der Embryogenese und des Geschlechts der Insekten und zur Durchführung molekularer Analysen mit reifen Embryonen.
Eines der Hindernisse für die Schädlingsinsektenforschung ist die Etablierung von Aufzuchtmethoden. Vor allem Inzucht wirkt sich manchmal negativ auf die Fitness der Art aus. Die Fitnessverringerung durch…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken der Unterstützung durch die Forschungsstipendien der Japan Society for the Promotion of Science (JSPS) für junge Wissenschaftler [Fördernummer 19J13123 und 21J00895].
Materials
| 1/2 ounce cup | FP CHUPA | CP070009 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/ |
| 1/2 ounce cup lid | FP CHUPA | CP070011 | insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether |
| 99.7% acetic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 36289 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html |
| Agilent 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument |
| Agilent RNA6000 nano kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | Nucleic acids quantification; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG |
| benzalkonium chloride solution | Nihon Pharmaceutical Co., Ltd | No.4987123116046 | Sterilization; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html |
| Cotton | AOUME | 8-1611-02 | insect rearing; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1 |
| DAPI solution | Dojindo, Tokyo, Japan | 340-07971 | stainings; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/ |
| Disodium Hydrogenphosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Na2HPO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html |
| dsDNA HS quantification kit | Invitrogen | Q33231 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230 |
| Econospin RNA II column | Epoch Life Science Inc. | EP-11201 | RNA extraction; http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx |
| Ethanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html |
| Ethylenediamine-N,N,N',N'-tetraacetic Acid Tetrasodium Salt Tetrahydrate (4NA) | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (EDTA); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html |
| Glassine paper | HEIKO | 2100010 | insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla& utm_medium=cpc&utm_source= Adw |
| heat block WSC-2620 PowerBLOCK | ATTO, Tokyo, Japan | 4002620 | incubation; https://www.attoeng.site/ |
| heptane | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html |
| INSECTA LF | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| ISOGENII | Nippon Gene | 311-07361 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html |
| isopropanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | nucleic acids extraction; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html |
| Lactic acid | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html |
| methanol | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html |
| MSV-3500 vortex | Biosan | BS-010210-TAK | Voltex mixer; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/ |
| Nano Photometer NP 80 | Implen | not shown | Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/ |
| Natural pack wide | Inomata chemical | 1859 | insect rearing; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3% 83%A9%E3%83%AB%E3%83%91% E3%83%83%E3%82%AF%E3%83% AF%E3%82%A4%E3%83%89 |
| NEBNext Ultra II RNA Library Prep Kit for Illumina | New England BioLabs | E7770S | Library preparation; https://www.nebj.jp/products/detail/2039 |
| orcein | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html |
| Paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 160-16061 | fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html |
| Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html |
| Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) | Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan | not shown | Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328 |
| Potassium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html |
| ProLong Diamond Antifade Mountant | Invitrogen, MA, USA | P36965 | antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965 |
| Proteinase K Solution | Merck | 71049-4CN | DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049 |
| protein precipitation solution | Qiagen | 158912 | DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC |
| Qubit V4 | Invitrogen | Q33238 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238 |
| rifampicin | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html |
| RNA HS quantification kit | Invitrogen | Q32855 | Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852 |
| RNase solution | Nippon Gene | 313-01461 | RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html |
| Silk Mate 2S | Nosan Co., Ltd | not shown | Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm |
| Sodium Chloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html |
| Sodium Dodecyl Sulfate | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html |
| sodium hypochlorite aqueous solution | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html |
| Tetracycline Hydrochloride | FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan | 4.98748E+12 | Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html |
| Tris-HCl | FUJIFILM Wako Chemicals Co. | 4.98748E+12 | Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html |
| ultra-pure distilled water | Invitrogen | 10977023 | RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015 |
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