Summary

Élevage de masse et études moléculaires chez les insectes nuisibles tortricidae

Published: March 25, 2022
doi:

Summary

Le présent protocole décrit la méthode d’élevage des insectes ravageurs tortricides dans les laboratoires. Les procédures permettant de distinguer le sexe des insectes et d’extraire les acides nucléiques pour le séquençage à haut débit sont établies à l’aide de deux ravageurs tortricides.

Abstract

Les tortricidae (lépidoptères), communément appelés tortrix ou tordeuses, comprennent de nombreux ravageurs agricoles et forestiers, qui causent de graves pertes agricoles. Pour comprendre la biologie de ces papillons nuisibles, les techniques fondamentales ont été très demandées. Ici, des méthodes d’élevage de masse, d’observations et d’études moléculaires sont développées à l’aide de deux tortrix de thé, Homona magnanima et Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Les insectes ont été élevés en masse avec un régime artificiel tranché et maintenus par consanguinité pendant plus de 100 générations en tenant compte de leurs caractéristiques biologiques. Les insectes ont divers dimorphismes sexuels; par conséquent, il est difficile de distinguer le sexe pendant les stades de développement, qui ont empêché les tests ultérieurs. Le présent travail a mis en évidence que le sexe des larves de tortricides pouvait être déterminé en observant les testicules ou la coloration lactique-acétique de l’orcéine pour visualiser le chromosome W spécifique à la femelle. De plus, en utilisant les méthodes de détermination du sexe, la présente étude a permis d’extraire des acides nucléiques d’embryons déterminés par le sexe et de les appliquer au séquençage à haut débit. Ces conseils sont applicables à d’autres insectes nuisibles et faciliteront d’autres études morphologiques et génétiques.

Introduction

Les insectes lépidoptères représentent plus de 10 % de toutes les espèces vivantes décrites1, et certaines espèces de taxons causent de graves dommages aux plantes et de graves pertes agricoles 2,3. Bien que des études moléculaires et génétiques aient été développées à l’aide d’insectes modèles tels que le ver à soie Bombyx mori 4,5, les insectes nuisibles n’ont pas encore fait l’objet d’enquêtes, en partie à cause des difficultés d’élevage et de manipulation 6,7. Par conséquent, des études et des techniques fondamentales sont nécessaires pour comprendre la biologie de ces insectes nuisibles non modèles.

Les Tortricidae (Lépidoptères), communément appelés tortrix ou tordeuses, comprennent de nombreux ravageurs agricoles et forestiers8. Parmi les taxons d’insectes, la tortrix de thé orientale Homona magnanima Diakonoff et la tortrix de fruits d’été Adoxophyes honmai Yasuda sont de graves ravageurs polyphages connus pour endommager les théiers en Asie de l’Est7. Les deux espèces pondent des grappes d’œufs plates et ovales en forme d’écailles (ou masses d’œufs) constituées d’œufs minces, mous et fragiles recouverts de sécrétions maternelles. Bien que les stades de l’embryogenèse soient cruciaux pour le développement des insectes et la détermination du sexe9, les structures des œufs empêchent une analyse plus approfondie de comprendre la biologie des insectes. Il est important de surmonter les difficultés pour une étude plus approfondie sur les ravageurs ovipositant une masse d’œufs aussi complexe.

Ici, pour comprendre la biologie des tortricides, des méthodes d’élevage de masse, des observations et des études moléculaires ont été développées à l’aide de A. honmai et H. magnanima. Tout d’abord, les méthodes d’élevage de masse maintiennent les deux tortricides sur 100 générations par consanguin. La séparation des œufs de la masse d’œufs concaténée en forme d’écailles a facilité l’observation de l’embryogenèse des tortricides à l’aide de solvants alcalins et organiques précédemment développés à partir de techniques utilisées chez les mouches10. En outre, la présente étude a établi la discrimination sexuelle des petits embryons en développant des méthodes de coloration de la chromatine sexuelle des femelles lépidoptères utilisant l’orcéine lactique-acétique11. En combinant ces méthodes, des acides nucléiques de haute qualité et de grande quantité ont été extraits d’embryons déterminés par le sexe, ce qui était autrement difficile à établir6. L’ARN extrait a été utilisé pour le séquençage de nouvelle génération. Collectivement, les méthodes présentées ici s’appliquent à d’autres insectes lépidoptères et à d’autres taxons d’insectes.

Protocol

1. Collecte d’insectes et élevage de masse Collectez des insectes tortricides dans les champs en suivant les références 8,12 publiées précédemment.REMARQUE : Les larves de H. magnanima et d’A. honmai sont prélevées sur des feuilles de thé endommagées (figure 1A); les adultes sont attirés par la lumière UV portable de 4 W (longueur d’onde de 365 nm, voir tablea…

Representative Results

Mise en place des lignes hôtes et leur maintenanceLa viabilité des larves collectées sur le terrain est attribuée différemment à l’emplacement, aux saisons et aux conditions d’élevage sur le terrain (p. ex., 90 % de la viabilité à Taïwan, Taoyuan, comme le montrent Arai et al.12). Environ 30% à 50% des paires généreront la prochaine génération comme d’habitude. Pour H. magnanima et A. honmai, les matrilines sont maintenues par consanguini…

Discussion

Tortricid comprend plusieurs ravageurs agricoles et forestiers; la présente étude a présenté des méthodes pour élever la tortrix au fil des générations, observer l’embryogenèse et le sexe des insectes, et effectuer une analyse moléculaire à l’aide d’embryons matures.

L’un des obstacles à l’étude des insectes nuisibles est d’établir des méthodes d’élevage. En particulier, la consanguinité affecte parfois négativement la condition physique de l’espèce. La rédu…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Les auteurs souhaitent reconnaître le soutien de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) Bourses de recherche pour jeunes scientifiques [numéro de subvention 19J13123 et 21J00895].

Materials

1/2 ounce cup FP CHUPA CP070009 insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010417/
1/2 ounce cup lid FP CHUPA CP070011 insect rearing; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether
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dsDNA HS quantification kit Invitrogen Q33231 Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230
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Glassine paper HEIKO 2100010 insect rearing; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&
utm_medium=cpc&utm_source=
Adw
heat block WSC-2620 PowerBLOCK ATTO, Tokyo, Japan 4002620 incubation; https://www.attoeng.site/
heptane FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 fixation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html
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Nano Photometer NP 80 Implen not shown Nucleic acids quantification; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/
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E3%83%83%E3%82%AF%E3%83%
AF%E3%82%A4%E3%83%89
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orcein FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Stainings; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html
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Polyoxyethylene(20) Sorbitan Monolaurate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Tween-20; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html
Portable UV Black Light (4W, 365nm wavelength) Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japan not shown Insect collection; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328
Potassium Chloride FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 KCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html
Potassium Dihydrogen Phosphate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 KH2PO4; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html
ProLong Diamond Antifade Mountant Invitrogen, MA, USA P36965 antifade; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965
Proteinase K Solution Merck 71049-4CN DNA extraction; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049
protein precipitation solution Qiagen 158912 DNA extraction; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_
BIOCOMPARE_ProductListing_
0121_RD_MarketPlace_ProductC
Qubit V4 Invitrogen Q33238 Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238
rifampicin FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html
RNA HS quantification kit Invitrogen Q32855 Nucleic acids quantification; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852
RNase solution Nippon Gene 313-01461 RNA extraction; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html
Silk Mate 2S Nosan Co., Ltd not shown Artificial diet; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm
Sodium Chloride FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 NaCl; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html
Sodium Dodecyl Sulfate FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Cell lysis buffer (SDS); https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html
sodium hypochlorite aqueous solution FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 egg separation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html
Tetracycline Hydrochloride FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japan 4.98748E+12 Sterilization; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html
Tris-HCl FUJIFILM Wako Chemicals Co. 4.98748E+12 Cell lysis buffer; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html
ultra-pure distilled water Invitrogen 10977023 RNA extraction; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015

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Citar este artigo
Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects. J. Vis. Exp. (181), e63737, doi:10.3791/63737 (2022).

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