Lipidomica shotgun di tessuti di roditori

Sebbene i progressi nella SM abbiano prodotto una varietà di metodi per monitorare accuratamente molte specie lipidiche, il precedente profilo lipidico di vari tessuti di mammifero non ha mostrato risultati coerenti e, di conseguenza, le particolari funzioni tessuto-specifiche dei lipidi rimangono poco chiare. Rispetto all’analisi funzionale delle proteine, per la quale sono disponibili approcci più robusti per eliminare l’espressione di particolari composti, la maggior parte dei lipidi non può essere selettivamente disattivata o sovraespressa nei tessuti, rendendo difficile la valutazione funzionale dei lipidi. La profilazione avanzata delle concentrazioni di lipidi tissutali può fornire un approccio alternativo per identificare le associazioni tra lipidi circolanti e malattie umane.

Nel valutare metodi lipidomici completi in grado di coprire qualitativamente e quantitativamente il profilo lipidico endogeno di qualsiasi tessuto murino, abbiamo dato la preferenza al metodo lipidomica shotgun. In generale, sono possibili due tipi opposti di analisi del campione: o uno screening completamente non mirato dei lipidi utilizzando la separazione basata sulla cromatografia liquida (LC) con ulteriore rilevamento spettrometrico di massa per rivelare la complessità lipidica totale del campione, o approcci mirati, che consentono per lo più una quantificazione molto precisa di specifici lipidi di interesse. Al contrario, la caratteristica forte del flusso di lavoro della lipidomica shotgun presentato è la rapida copertura completa di centinaia di lipidi endogeni da classi lipidiche predefinite, che possono ancora essere eseguite in modo semi-quantitativo robusto.

Le efficienze di ionizzazione delle diverse classi lipidiche sono dipendenti dalla struttura e possono variare drasticamente a seconda delle diverse condizioni di ionizzazione sperimentale. A differenza dei metodi di separazione basati su LC, l’analisi shotgun riduce al minimo queste differenze grazie all’infusione diretta simultanea dell’intero estratto lipidico nelle stesse condizioni di ionizzazione nello strumento MS. L’uso di analoghi lipidici marcati isotopicamente o standard strutturalmente simili non endogeni consente la semi-quantificazione di tutte le classi lipidiche. La lipidomica shotgun fornisce una bassa variabilità inter- e intra-run durante l’analisi della SM; Di conseguenza, questo metodo produce coefficienti di variazione²¹ inferiori rispetto ai metodi basati sulla cromatografia liquida non mirata, che richiedono più standard per una quantificazione adeguata. È importante sottolineare che, sebbene nel metodo corrente non venga utilizzata alcuna curva di calibrazione esterna, il metodo è ancora considerato pienamente quantitativo³².

Un livello di standard interno marcato (o standard non etichettato che non è espresso in modo endogeno) per classe lipidica è sufficiente per la quantificazione della maggior parte dei lipidi. Solo poche pubblicazioni hanno riportato una convalida parziale del metodo per un metodo di lipidomica shotgun. Ad esempio, in Gryzbek et ^al.17 e Surma et ^al.21, sono state preparate curve di calibrazione invertite utilizzando standard interni e una quantità fissa di matrice di campionamento. La linearità è stata valutata dalla regressione lineare delle quantità lipidiche log-trasformate e delle loro intensità e riportata rispettivamente come R² e pendenza. Il limite di rilevamento (LOD) e il limite di quantificazione (LOQ) sono stati determinati mediante regressione lineare ponderata basata su un rapporto segnale-rumore di 3 per LOD e 10 per LOQ. Per la maggior parte delle classi lipidiche, il LOQ è stato definito tra 2-9,8 pmol per il tessuto adiposo e 0,05-5μM nel plasma. In entrambi i casi, sono stati utilizzati singoli standard interni non endogeni per classe per ricavare stime per tutti i lipidi della classe. Tuttavia, in questo lavoro, non forniamo LOD / LOQ a causa di diverse preoccupazioni: la matrice endogena non è priva di composti e la matrice surrogata per i tessuti non è disponibile – con questo, il picco di piccole quantità note di standard non è possibile. Non eseguiamo un classico approccio di quantificazione mirata con l’uso di una serie di curve di calibrazione di un particolare composto normalizzato dal suo identico standard isotopicamente marcato a causa dell’inesistenza di standard puri e della disponibilità molto limitata di lipidi marcati isotopicamente. I rivelatori Orbitrap eseguono automaticamente la conversione del segnale transitorio applicando una trasformazione di Fourier, e alcuni segnali sono già sostituiti – di conseguenza, l’intervallo di concentrazione inferiore sarà solo lineare fino a qualche segnale minimo, al di sotto del quale la molecola non sarà più rilevabile. I valori segnale-rumore del software Xcalibur dipendono dal rapporto m/z della molecola; Di conseguenza, i composti di ciascuna classe lipidica, contenenti diverse combinazioni di acidi grassi, avranno valori di rumore diversi. Inoltre, i valori di LOQ/LOQ sono strettamente legati al tipo di matrice e, quando la quantificazione del lipidoma viene effettuata in diversi tessuti di roditori, dovrebbe riflettersi nella valutazione dei LOQ per ciascun tipo di tessuto individualmente.

Infatti, il metodo offre un elevato intervallo di quantificazione dinamica lineare fino a quattro ordini di grandezza³³ e un’ottima sensibilità per coprire i più importanti lipidi strutturali endogeni, che possono essere ulteriormente aumentati da miglioramenti tecnici nell’acquisizione della SM³². I coefficienti di variazione delle concentrazioni lipidiche medie erano per lo più inferiori al 15%, il che significa che la lipidomica del fucile è conforme ai requisiti della Food and Drug Administration (FDA) come metodo da prendere in considerazione per gli studi di buona pratica di laboratorio (GLP) e buona pratica clinica (GCLP)³⁴.

Tuttavia, va notato che, a causa della loro diversa polarità, alcune classi lipidiche diventano molto più influenzate dal contributo di specifici FA coniugati. Ciò porta alla distorsione nella risposta di intensità in miscele equimolari contenenti un’ampia gamma di FA coniugati, con conseguente bias di quantificazione, come evidenziato da Koivusalo et ^al.35 per le classi di fosfolipidi. Da notare, questi autori hanno presentato dati per una vasta gamma di FA, da 24-48 lunghezza della catena, che probabilmente non riflette la situazione in un campione biologico reale. La risposta per le specie polinsaturi è stata superiore del 40% rispetto alle specie completamente sature, ma questo effetto è stato osservato solo per concentrazioni più elevate. Quando la miscela è stata progressivamente diluita, l’effetto dell’insaturazione è gradualmente diminuito e praticamente scomparso a 0,1 pmol/μL per specie. Inoltre, tutte le misurazioni sono state effettuate su strumenti a trappola ionica e tripli quadrupoli e non su apparecchiature Q-Exactive.

Un altro vantaggio del flusso di lavoro presentato è la sua flessibilità tecnica, che consente l’adattamento a requisiti specifici del progetto. Ad esempio, qualsiasi protocollo di estrazione lipidica – come i metodi modificati Bligh e Dyer³⁶, metil terz-butil etere 37 o butanolo-metanolo³⁸ – può essere utilizzato per preparare un estratto lipidico totale prima dell’analisi MS. Il principale limite dell’estrazione cloroformio-metanolo è che la fase inferiore contiene la frazione lipidica, il che complica il lavoro di routine e soprattutto l’automazione; Inoltre, deve essere considerata la tossicità del cloroformio. L’estrazione con terz-butil etere è ampiamente utilizzata per l’analisi lipidica di campioni di plasma³⁷ ed è stata proposta una versione automatizzata²¹. In questo caso, abbiamo scelto il metodo BUME perché fornisce recuperi ancora migliori per le classi lipidiche PG, PI, PA e PS³⁸, un minore consumo di solvente e la possibilità di automazione³⁹, mentre le concentrazioni complessive quantificate per i campioni di tessuto estratti con tutti e tre i metodi erano comparabili. Inoltre, mentre l’estrazione del campione è stata eseguita manualmente nel lavoro corrente, è anche possibile ottenere risultati riproducibili e precisi da grandi set di campioni mediante la preparazione automatica del campione e l’estrazione dei lipidi in un formato a 96 pozzetti^40,41. Ciò consente di implementare l’analisi lipidomica in studi clinici e tossicologici su larga scala.

Nel lavoro attuale, abbiamo eseguito l’acquisizione MS di modi positivi e negativi separatamente senza commutazione di polarità come descritto da Schuhmann et ^al.42. La stabilità del segnale nanomate è migliore in modalità negativa per una soluzione leggermente meno concentrata rispetto alla modalità positiva. Inoltre, abbiamo sviluppato una procedura completamente tracciabile con il software di conversione da file .raw a mzML, che fornisce i valori da specificare nel software LipidXplorer – con questo, non sono necessari calcoli manuali della pendenza della risoluzione. Abbiamo anche applicato diverse sostituzioni di impostazione del rumore perché, in modalità positiva, i livelli di rumore degli spettri sono più alti rispetto alla modalità negativa. Tutti i passaggi sono stati ottimizzati per analisi di routine tracciabili e ad alto rendimento.

Per l’identificazione, l’analisi lipidomica shotgun può sfruttare il comportamento unico di diverse classi lipidiche, che formano addotti unici in diverse modalità di polarità. In questo metodo, le specie di PC e PE con la stessa massa molecolare che si sovrappongono nel modo di ionizzazione positiva possono essere completamente separate nella modalità di ionizzazione negativa, poiché il PC forma addotti acetato o formiato e il PE viene ionizzato in forma deprotonata. Inoltre, la deconvoluzione strutturale (parziale) è possibile per il metodo utilizzando non solo la formula molecolare ma anche la struttura degli acidi grassi sfusi. Ad esempio, l’identificazione FA sul livello del carbonio totale e del conteggio totale dell’insaturazione funziona per tutti i fosfolipidi, DAG, TAG e liso-fosfolipidi. La quantificazione bottom-up di ciascuna forma isomerica può essere parzialmente eseguita per alcune delle classi di fosfolipidi⁴³ , ma è molto più complessa per DAG e TAG a causa della risposta ineguale del segnale di diversi FA negli spettri MS2.

È altresì importante sottolineare la necessità di attuare adeguate procedure di controllo della qualità, pienamente in linea con le recenti iniziative in questo settore⁴⁴. Poiché desideriamo garantire un’adeguata tracciabilità e riproducibilità dei dati tra e all’interno del laboratorio, sono state adottate una serie di misure come la corretta randomizzazione dei campioni per tutte le fasi dell’analisi, il lavoro con miscele standard certificate dal fornitore, l’inclusione di campioni di controllo qualità, procedure per verificare l’accettazione o il rifiuto dei lotti e la creazione di un database interno per monitorare le prestazioni del controllo qualità a lungo termine. Coerente con queste iniziative è anche la necessità di un metodo standardizzato per affrontare la stabilità del campione. In generale, la maggior parte dei lipidi strutturali non è influenzata dall’ossidazione lipidica, che è più rilevante per le ossipiline, i lipidi ossidati e gli acidi grassi polinsaturi che sono, quindi, molto più sensibili alle condizioni di conservazione e manipolazione. Tuttavia, la corretta valutazione della stabilità del campione è ancora un compito tecnicamente impegnativo.

Tuttavia, questo protocollo ha una limitazione quando si tratta di determinare i livelli submolecolari dei composti. Considerando che non vi è separazione dell’estratto totale, tutte le isoforme di lipidi con la stessa massa molecolare ma diverse composizioni di acidi grassi sono fuse nell’analisi MS. Per la maggior parte delle classi, è possibile ottenere una deconvoluzione parziale della struttura utilizzando i rapporti di frammentazione dei frammenti di acidi grassi residui in MS2. Tuttavia, la quantificazione indipendente di ciascuna isoforma rimane un compito particolarmente impegnativo a causa delle grandi differenze nei comportamenti di frammentazione delle diverse isoforme e del fatto che gli standard chimici puri non sono disponibili in una varietà sufficientemente ampia per definire i valori di compensazione. Un’altra limitazione è che il processo ESI genera inevitabilmente artefatti, con conseguente generazione artificiale di picchi per alcuni lipidi come DAG, Pas e FA, che possono portare a una quantificazione errata.

Successivamente, riassumiamo le parti più critiche del protocollo in base alla nostra esperienza. Il primo è legato al fatto che ogni tipo di tessuto di topo ha un profilo lipidico unico sia in termini di quantità lipidica che di rapporti di classe. Con questo, le quantità iniziali del tessuto basate sul contenuto proteico totale prima dell’estrazione devono essere attentamente determinate al fine di non saturare il segnale MS e non lasciare l’intervallo di quantificazione dinamica a causa dell’aggregazione lipidica ad alte concentrazioni³³ o – all’estremo opposto – per fornire un segnale MS sufficiente a coprire i principali composti lipidici per ciascuna classe lipidica.

Il secondo aspetto critico è quello di garantire un corretto allineamento della posizione dell’uscita del chip nano-sorgente di infusione diretta con il capillare di trasferimento dello spettrometro di massa. Considerando che la calibrazione completa dello spettrometro di massa in entrambe le modalità viene eseguita settimanalmente, lo scambio tra la sorgente di calibrazione e la configurazione del chip nano-sorgente può essere la ragione di una drammatica variabilità nell’intensità del segnale a causa del disallineamento durante l’installazione.

Un’altra parte critica del protocollo è l’attenta gestione della miscela standard interna. Poiché questa miscela contiene una quantità significativa di diclorometano, una volta aperta, dovrebbe essere consumata rapidamente per evitare una lunga conservazione e molteplici usi che portano all’evaporazione e al cambiamento di concentrazione artificiale. Inoltre, è importante una manipolazione costante della miscela standard dopo la rimozione dallo stoccaggio a -20 °C, poiché le differenze di temperatura possono portare a incoerenze di volume durante il pipettaggio con pipette a cuscino d’aria. Un’opzione sarebbe quella di sostituire il diclorometano nel tampone di risospensione standard con metanolo puro, che potrebbe migliorare la praticità di manipolazione ma potrebbe influire negativamente sulla solubilità di alcune classi lipidiche e, quindi, ridurre l’accuratezza della quantificazione per queste classi lipidiche.

L’ultima parte critica è l’elaborazione dei dati. Il flusso di lavoro di elaborazione dei dati combina la conversione del software Peak by Peak dal formato .raw al formato .mzML, applicando la media di scansione MS2 e la filtrazione del rumore MS1 e MS2, nonché il prelievo dei picchi e la compressione dei dati. In alternativa, il software Proteowizard può essere utilizzato anche per la conversione dei dati, ma, in questo caso, diverse impostazioni in LipidXplorer devono essere definite manualmente. Tutta la complessità della lipidomica shotgun è particolarmente concentrata sulla fase di deconvoluzione degli spettri MS1 e MS2 a iniezione diretta. Il software open source LipidXplorer importa gli spettri convertiti dal formato di file mzML in base alla precisione della massa, alla risoluzione di massa e alla pendenza della sua modifica con l’aumentare di m / z. Il software unisce più singoli spettri MS e MS/MS acquisiti all’interno di un’analisi. Successivamente, allinea i singoli picchi all’interno di diverse esecuzioni di campioni e, in ogni gruppo di picchi allineati, sostituisce le loro masse con la loro massa media ponderata per la singola intensità, mentre le loro abbondanze in ciascun file di dati rimangono intatte. Le masse rappresentative dei cluster di picco allineati e le singole intensità di picco sono memorizzate in un database di scansione master. Il database di scansione master contiene tutti gli spettri MS1 e MS2 generati per tutti i campioni nel batch e può essere deconvoluto alle identificazioni lipidiche mediante query scritte nel linguaggio di query di frammentazione molecolare (MFQL).

Nel complesso, il metodo copre l’identificazione dei lipidi DAG, TAG e SE basati sulla modalità positiva e lipidi PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC e LPE basati sull’acquisizione in modalità negativa. Durante l’identificazione dei lipidi, viene eseguita la correzione isotopica per MS1 e MS2 e le intensità regolate sono riportate nel file di output .xlsx. In alternativa, sono disponibili diversi altri software per elaborare i dati del fucile, come ALEX⁴⁵ e LipidHunter⁴⁶.

Gli acidi grassi – i principali componenti della membrana nucleare e cellulare – sono immagazzinati sotto forma di fosfolipidi per un’ulteriore conversione in molecole bioattive. Possono essere convertiti dagli enzimi lisofosfolipidi aciltransferasi in lisofosfolipidi attraverso la via Lands⁴⁷. L’enzima LPCAT3, ad esempio, è noto per mostrare un’elevata specificità per incorporare AA negli intermedi lisofosfatidilcolina e lisofosfatidilserina. L’espressione relativamente elevata di questi enzimi è stata riportata all’interno delle cellule infiammatorie, come i macrofagi alveolari e le cellule epiteliali bronchiali⁴⁷, portando al rilascio di proporzioni relative maggiori di fosfolipidi contenenti AA in quelle cellule. Tuttavia, in seguito alla loro liberazione dai fosfolipidi di membrana da parte della fosfolipasi A2, la conversione dei PUFA in vari tipi di mediatori lipidici è catalizzata da molti enzimi⁴⁸. Inoltre, questi PUFA possono diventare il substrato per la produzione di prostaglandine pro-infiammatorie e anti-infiammatorie attraverso l’azione degli enzimi cicloossigenasi (COX)-1 e COX-2⁴⁷. I fosfolipidi sono una delle fonti di mediatori lipidici rilasciati in particolari luoghi in cui questi mediatori sono tenuti a dimostrare i loro effetti biologici.

Il polmone è un organo complesso che comprende più tipi di cellule, ognuna delle quali svolge ruoli sovrapposti e di nicchia nel facilitare il normale sviluppo e la funzione polmonare. Sono stati condotti solo pochi studi per isolare e profilare diversi tipi di cellule nel topo o nel polmone umano (ad esempio, cellule alveolari di tipo 2)^49,50; Altri tipi principali di cellule polmonari non sono stati caratterizzati. Un altro interessante studio⁵¹ è stato condotto per isolare ed eseguire analisi lipidiche di cellule immunitarie endoteliali, epiteliali, mesenchimali e miste nel polmone del topo. È stato osservato che la concentrazione di PUFA incorporati in PCO e PG era arricchita nelle cellule immunitarie. Considerando il fatto che la CS induce un aumento delle cellule immunitarie all’interno del polmone (4-5 volte), come valutato dal lavaggio broncoalveolare (BAL)⁵², i cambiamenti lipidici totali osservati in questo studio potrebbero essere spiegati da un aumento cumulativo del reclutamento delle cellule immunitarie nel polmone del topo.

In conclusione, la distorsione osservata degli acidi grassi monoinsaturi e dei PUFA incorporati nei fosfolipidi può riflettere l’eccesso di alcuni FA all’interno della cellula e/o costituire una risorsa intracellulare di precursori dell’ossilpina che sono sovraprodotti sotto stress ossidativo e condizioni infiammatorie. Tuttavia, ulteriori dati su EPA libero, DHA e altre ossilipine sono essenziali per chiarire questo punto e non rientrano nell’ambito dell’attuale applicazione del metodo.