Lipidomique de tissus de rongeurs

Bien que les progrès de la SP aient donné lieu à diverses méthodes pour surveiller avec précision de nombreuses espèces lipidiques, le profilage lipidique antérieur de divers tissus de mammifères n’a pas donné de résultats cohérents et, par conséquent, les fonctions tissulaires particulières des lipides restent incertaines. En comparaison avec l’analyse fonctionnelle des protéines, pour laquelle des approches plus robustes pour éliminer l’expression de composés particuliers sont disponibles, la majorité des lipides ne peuvent pas être sélectivement désactivés ou surexprimés dans les tissus, ce qui rend l’évaluation fonctionnelle des lipides difficile. Le profilage avancé des concentrations de lipidomes tissulaires peut fournir une approche alternative pour identifier les associations entre les lipides circulants et les maladies humaines.

Lors de l’évaluation de méthodes lipidomiques complètes capables de couvrir qualitativement et quantitativement le profil lipidique endogène de n’importe quel tissu de souris, nous avons donné la préférence à la méthode lipidomique au fusil de chasse. En général, deux types opposés d’analyse d’échantillons sont possibles : soit un criblage complètement non ciblé des lipides par séparation basée sur la chromatographie liquide (CL) avec une détection par spectrométrie de masse supplémentaire pour révéler la complexité lipidique totale de l’échantillon, soit des approches ciblées, qui permettent principalement une quantification très précise des lipides spécifiques d’intérêt. En revanche, la caractéristique forte du flux de travail lipidomique présenté est la couverture complète rapide de centaines de lipides endogènes à partir de classes de lipides prédéfinies, qui peut encore être réalisée de manière semi-quantitative robuste.

Les efficacités d’ionisation des différentes classes de lipides dépendent de la structure et peuvent varier considérablement en fonction des différentes conditions expérimentales d’ionisation. Contrairement aux méthodes de séparation basées sur la LC, l’analyse au fusil de chasse minimise ces différences en raison de l’infusion simultanée directe de l’extrait lipidique entier dans les mêmes conditions d’ionisation dans l’instrument MS. L’utilisation d’analogues lipidiques marqués isotopiquement ou d’étalons non endogènes structurellement similaires permet une semi-quantification de toutes les classes de lipides. La lipidomique de fusil de chasse offre une faible variabilité inter- et intra-run pendant l’analyse de la SEP; Par conséquent, cette méthode produit des coefficients de variation²¹ inférieurs à ceux des méthodes non ciblées fondées sur la chromatographie liquide, qui nécessitent plusieurs normes pour une quantification adéquate. Il est important de noter que, bien qu’aucune courbe d’étalonnage externe ne soit utilisée dans la méthode actuelle, la méthode est toujours considérée comme entièrement quantitative³².

Un niveau d’étalon interne marqué (ou d’étalon non étiqueté qui n’est pas exprimé de manière endogène) par classe de lipides est suffisant pour la quantification de la plupart des lipides. Seules quelques publications ont fait état d’une validation partielle d’une méthode lipidomique au fusil de chasse. Par exemple, dans Gryzbek et ^coll.17 et Surma et ^coll.21, des courbes d’étalonnage inversées ont été préparées à l’aide d’étalons internes et d’une quantité fixe de matrice d’échantillons. La linéarité a été évaluée par la régression linéaire des quantités de lipides transformées logarithmiques et de leurs intensités et rapportée comme R² et pente, respectivement. La limite de détection (LD) et la limite de quantification (LOQ) ont été déterminées par régression linéaire pondérée basée sur un rapport signal/bruit de 3 pour LOD et de 10 pour LOQ. Pour la plupart des classes de lipides, la LQ a été définie entre 2 et 9,8 pmol pour le tissu adipeux et entre 0,05 et 5 μM dans le plasma. Dans les deux cas, des étalons internes uniques non endogènes par classe ont été utilisés pour calculer les estimations de tous les lipides de la classe. Cependant, dans ce travail, nous ne fournissons pas de LD / LOQ en raison de plusieurs préoccupations: la matrice endogène n’est pas exempte de composés et la matrice de substitution pour les tissus n’est pas disponible – avec cela, le pic de petites quantités connues d’étalons n’est pas possible. Nous n’effectuons pas une approche classique de quantification ciblée avec l’utilisation d’une série de courbes d’étalonnage d’un composé particulier normalisé par son étalon identique marqué isotopiquement en raison de l’inexistence d’étalons purs et de la disponibilité très limitée de lipides marqués isotopiquement. Les détecteurs Orbitrap effectuent automatiquement la conversion du signal transitoire en appliquant une transformation de Fourier, et un signal est déjà substitué – en conséquence, la plage de concentration inférieure ne sera linéaire que jusqu’à un signal minimum, en dessous duquel la molécule ne sera plus détectable. Les valeurs signal/bruit du logiciel Xcalibur dépendent du rapport m/z de la molécule ; En conséquence, les composés de chaque classe de lipides, contenant différentes combinaisons d’acides gras, auront des valeurs de bruit différentes. De plus, les valeurs de LQ/LOQ sont strictement liées au type de matrice, et lorsque la quantification du lipidome est effectuée dans différents tissus de rongeurs, elle devrait être reflétée par l’évaluation des LQ pour chaque type de tissu individuellement.

En fait, la méthode offre une plage de quantification dynamique linéaire élevée allant jusqu’à quatre ordres de grandeur³³ et une très bonne sensibilité pour couvrir les lipides structurels endogènes les plus importants, qui peuvent être encore augmentées par des améliorations techniques dans l’acquisition de MS³². Les coefficients de variation des concentrations moyennes de lipides étaient pour la plupart inférieurs à 15 %, ce qui signifie que la lipidomique de fusil de chasse est conforme aux exigences de la Food and Drug Administration (FDA) en tant que méthode à envisager pour les études de bonnes pratiques de laboratoire (BPL) et de bonnes pratiques cliniques (GCLP)³⁴.

Cependant, il faut noter que, en raison de leur polarité différente, certaines classes de lipides deviennent beaucoup plus impactées par la contribution d’AF conjugués spécifiques. Cela conduit à la distorsion de la réponse d’intensité dans les mélanges équimolaires contenant une large gamme d’acides gras conjugués, ce qui entraîne un biais de quantification, comme l’ont souligné Koivusalo et ^al.35 pour les classes de phospholipides. Il convient de noter que ces auteurs ont présenté des données pour un large éventail d’AF, allant de 24 à 48 longueurs de chaîne, ce qui ne reflète probablement pas la situation dans un échantillon biologique réel. La réponse pour les espèces polyinsaturées était 40% plus élevée que pour les espèces complètement saturées, mais cet effet n’a été observé que pour des concentrations plus élevées. Lorsque le mélange a été progressivement dilué, l’effet de l’insaturation a progressivement diminué et a pratiquement disparu à 0,1 pmol / μL par espèce. De plus, toutes les mesures ont été effectuées sur des instruments à piège à ions et à quadripôles triples et non sur de l’équipement Q-Exactive.

Un autre avantage du flux de travail présenté est sa flexibilité technique, qui permet une adaptation aux exigences spécifiques du projet. Par exemple, tout protocole d’extraction lipidique – tel que les méthodes modifiées de Bligh et Dyer³⁶, de méthyl tert-butyl^{éther 37} ou de butanol-méthanol³⁸ – peut être utilisé pour préparer un extrait lipidique total avant l’analyse de la SEP. La principale limitation de l’extraction chloroforme-méthanol est que la phase inférieure contient la fraction lipidique, ce qui complique le travail de routine et surtout l’automatisation; De plus, la toxicité du chloroforme doit être prise en compte. L’extraction au tert-butyléther est largement utilisée pour l’analyse lipidique des échantillons de plasma³⁷, et une version automatisée a été proposée²¹. Dans ce cas, nous avons choisi la méthode BUME parce qu’elle offre des récupérations encore meilleures pour les classes de lipides PG, PI, PA et PS³⁸, une consommation de solvant plus faible et la possibilité d’automatisation³⁹, tandis que les concentrations globales quantifiées pour les échantillons de tissus extraits par les trois méthodes étaient comparables. De plus, bien que l’extraction de l’échantillon ait été effectuée manuellement dans le cadre du présent travail, il est également possible d’obtenir des résultats reproductibles et précis à partir de grands ensembles d’échantillons par préparation automatisée des échantillons et extraction lipidique dans un format de 96 puits^40,41. Cela permet de mettre en œuvre l’analyse lipidomique dans des études cliniques et toxicologiques à grande échelle.

Dans le présent travail, nous avons effectué l’acquisition MS des modes positif et négatif séparément sans changement de polarité comme décrit par Schuhmann et ^al.42. La stabilité du signal nanomate est meilleure en mode négatif pour une solution légèrement moins concentrée qu’en mode positif. De plus, nous avons développé une procédure entièrement traçable avec un logiciel de conversion de fichiers .raw vers mzML, qui fournit les valeurs à spécifier dans le logiciel LipidXplorer – avec cela, les calculs manuels de pente de résolution ne sont pas nécessaires. Nous avons également appliqué différentes substitutions de réglage de bruit car, en mode positif, les niveaux de bruit des spectres sont plus élevés qu’en mode négatif. Toutes les étapes ont été optimisées pour des analyses de routine traçables et à haut débit.

Pour l’identification, l’analyse lipidomique au fusil de chasse peut exploiter le comportement unique de différentes classes de lipides, qui forment des adduits uniques dans différents modes de polarité. Dans cette méthode, les espèces PC et PE ayant la même masse moléculaire qui se chevauchent en mode d’ionisation positive peuvent être complètement séparées en mode d’ionisation négative, car PC forme des adduits à l’acétate ou au formate, et le PE est ionisé sous une forme déprotonée. De plus, une déconvolution structurelle (partielle) est possible pour la méthode utilisant non seulement la formule moléculaire, mais aussi la structure des acides gras en vrac. Par exemple, l’identification de l’AF sur le niveau de carbone total et le nombre total d’insaturations fonctionne pour tous les phospholipides, DAG, TAG et lyso-phospholipides. La quantification ascendante de chaque forme isomérique peut être partiellement réalisée pour certaines des classes de phospholipides⁴³ , mais elle est beaucoup plus complexe pour les DAG et les TAG en raison de la réponse inégale du signal des différents FA dans les spectres MS2.

Il importe également de souligner la nécessité de mettre en œuvre des procédures appropriées de contrôle de la qualité, pleinement alignées sur les initiatives récentes dans ce domaine⁴⁴. Comme nous souhaitons assurer une traçabilité et une reproductibilité appropriées des données entre et au sein du laboratoire, un certain nombre d’étapes ont été prises, telles que la randomisation appropriée des échantillons pour toutes les étapes de l’analyse, la collaboration avec des mélanges standard certifiés par les fournisseurs, l’inclusion d’échantillons de contrôle de la qualité, les procédures pour vérifier l’acceptation ou le rejet des lots et la création d’une base de données interne pour suivre le rendement du CQ à long terme. Ces initiatives sont également conformes à la nécessité d’une méthode normalisée pour assurer la stabilité de l’échantillon. En général, la majorité des lipides structuraux ne sont pas affectés par l’oxydation des lipides, ce qui est plus pertinent pour les oxilimines, les lipides oxydés et les acides gras polyinsaturés qui sont donc beaucoup plus sensibles aux conditions de stockage et de manipulation. Cependant, l’évaluation correcte de la stabilité de l’échantillon reste une tâche techniquement difficile.

Cependant, ce protocole a une limite lorsqu’il s’agit de déterminer les niveaux submoléculaires de composés. Étant donné qu’il n’y a pas de séparation de l’extrait total, toutes les isoformes de lipides ayant la même masse moléculaire mais des compositions différentes en acides gras sont fusionnées dans l’analyse MS. Pour la plupart des classes, il est possible d’obtenir une déconvolution partielle de la structure en utilisant les rapports de fragmentation des fragments d’acides gras résiduels dans MS2. Cependant, la quantification indépendante de chaque isoforme reste une tâche particulièrement difficile en raison des grandes différences dans les comportements de fragmentation des différentes isoformes et du fait que les étalons chimiques purs ne sont pas disponibles dans une variété suffisamment grande pour définir les valeurs de compensation. Une autre limite est que le processus ESI génère inévitablement des artefacts, ce qui entraîne la génération artificielle de pics pour certains lipides tels que les DAG, les PAS et les FA, ce qui peut conduire à une quantification erronée.

Ensuite, nous résumons les parties les plus critiques du protocole en fonction de notre expérience. Le premier est lié au fait que chaque type de tissu de souris a un profil lipidique unique en termes de quantité de lipides et de rapports de classe. Ainsi, les quantités initiales du tissu basées sur la teneur totale en protéines avant l’extraction doivent être soigneusement déterminées afin de ne pas saturer le signal MS et de ne pas quitter la plage de quantification dynamique due à l’agrégation lipidique à des concentrations élevées³³ ou – à l’extrême opposé – de fournir suffisamment de signal MS pour couvrir les principaux composés lipidiques pour chaque classe lipidique.

Le deuxième aspect critique est d’assurer un alignement correct de la position de la sortie de la puce nano-source à perfusion directe avec le capillaire de transfert du spectromètre de masse. Étant donné que l’étalonnage complet du spectromètre de masse dans les deux modes est effectué chaque semaine, le permutation entre la source d’étalonnage et la configuration de la puce nano-source peut être la raison de la variabilité spectaculaire de l’intensité du signal en raison d’un désalignement lors de l’installation.

Une autre partie essentielle du protocole est la manipulation minutieuse du mélange de normes internes. Comme ce mélange contient une quantité importante de dichlorométhane, une fois ouvert, il doit être consommé rapidement pour éviter un stockage prolongé et des utilisations multiples conduisant à l’évaporation et à la modification artificielle de la concentration. En outre, une manipulation cohérente du mélange étalon après le retrait du stockage à −20 °C est importante, car les différences de température peuvent entraîner des incohérences de volume pendant le pipetage avec des pipettes à coussin d’air. Une option consisterait à remplacer le dichlorométhane dans le tampon de remise en suspension standard par du méthanol pur, ce qui pourrait améliorer la commodité de manipulation, mais pourrait avoir une incidence négative sur la solubilité de certaines classes de lipides et, par conséquent, diminuer la précision de la quantification pour ces classes de lipides.

La dernière partie critique est le traitement des données. Le flux de travail de traitement des données combine la conversion logicielle Peak by Peak du format .raw au format .mzML, en appliquant la moyenne de numérisation MS2 et la filtration du bruit MS1 et MS2, ainsi que la sélection des pics et la compression des données. Comme alternative, le logiciel Proteowizard peut également être utilisé pour la conversion de données, mais, dans ce cas, plusieurs paramètres dans LipidXplorer doivent être définis manuellement. Toute la complexité de la lipidomique de fusil de chasse est particulièrement concentrée sur l’étape de déconvolution des spectres MS1 et MS2 par injection directe. Le logiciel open source LipidXplorer importe les spectres convertis à partir du format de fichier mzML en fonction de la précision de la masse, de la résolution de masse et de la pente de son changement avec l’augmentation de m / z. Le logiciel fusionne plusieurs spectres MS et MS/MS individuels acquis au cours d’une série d’analyses. Par la suite, il aligne les pics individuels dans différents échantillonnages et, dans chaque groupe de pics alignés, il remplace leurs masses par leur masse moyenne pondérée en fonction de l’intensité, tandis que leurs abondances dans chaque fichier de données restent inchangées. Les masses représentatives des grappes de pics alignées et des intensités de pics individuelles sont stockées dans une base de données de balayage maître. La base de données de balayage principal contient tous les spectres MS1 et MS2 générés pour tous les échantillons du lot et peut être décomplexée en identifications lipidiques par des requêtes écrites dans le langage de requête de fragmentation moléculaire (MFQL).

Dans l’ensemble, la méthode couvre l’identification des lipides DAG, TAG et SE en fonction du mode positif et des lipides PC, PE, PS, PI, PA, PG, SM, LPC et LPE basés sur l’acquisition en mode négatif. Lors de l’identification des lipides, une correction isotopique est effectuée pour MS1 et MS2, et les intensités ajustées sont indiquées dans le fichier de sortie .xlsx. Alternativement, plusieurs autres logiciels sont disponibles pour traiter les données des fusils de chasse, tels que ALEX⁴⁵ et LipidHunter⁴⁶.

Les acides gras – principaux composants de la membrane nucléaire et cellulaire – sont stockés sous forme de phospholipides pour une conversion ultérieure en molécules bioactives. Ils peuvent être convertis par les enzymes lysophospholipides acyltransférase en lysophospholipides par la voie des terres⁴⁷. L’enzyme LPCAT3, par exemple, est connue pour montrer une spécificité élevée pour incorporer AA dans les intermédiaires de la lysophosphatidylcholine et de la lysophosphatidylsérine. L’expression relativement élevée de ces enzymes a été rapportée dans les cellules inflammatoires, telles que les macrophages alvéolaires et les cellules épithéliales bronchiques⁴⁷, conduisant à la libération de plus grandes proportions relatives de phospholipides contenant des AA dans ces cellules. Cependant, suite à leur libération des phospholipides membranaires par la phospholipase A2, la conversion des AGPI en divers types de médiateurs lipidiques est catalysée par de nombreuses enzymes⁴⁸. De plus, ces AGPI peuvent devenir le substrat pour la production de prostaglandines pro-inflammatoires et anti-inflammatoires via l’action des enzymes cyclooxygénase (COX)-1 et COX-2⁴⁷. Les phospholipides sont l’une des sources de médiateurs lipidiques libérés à des endroits particuliers où ces médiateurs sont nécessaires pour démontrer leurs effets biologiques.

Le poumon est un organe complexe comprenant plusieurs types de cellules, chacune jouant des rôles de chevauchement et de niche dans la facilitation du développement et de la fonction pulmonaires normaux. Seules quelques études ont été réalisées pour isoler et profiler différents types de cellules dans les poumons de souris ou humains (p. ex. cellules alvéolaires de type 2)^49,50; D’autres grands types de cellules pulmonaires n’ont pas été caractérisés. Une autre étude intéressante⁵¹ a été réalisée pour isoler et effectuer une analyse lipidique des cellules immunitaires endothéliales, épithéliales, mésenchymateuses et mixtes dans le poumon de souris. Il a été observé que la concentration d’AGPI incorporés dans le BCP et le PG était enrichie dans les cellules immunitaires. Compte tenu du fait que le CS induit une augmentation des cellules immunitaires dans les poumons (4-5 fois), tel qu’évalué par lavage broncho-alvéolaire (BAL)⁵², les changements lipidiques totaux observés dans cette étude pourraient s’expliquer par une augmentation cumulative du recrutement des cellules immunitaires dans le poumon de souris.

En conclusion, la distorsion observée des acides gras monoinsaturés et des AGPI incorporés dans les phospholipides peut refléter l’excès de certains AF dans la cellule et/ou constituer une ressource intracellulaire de précurseurs d’oxilipine qui sont surproduits dans des conditions de stress oxydatif et inflammatoires. Cependant, des données supplémentaires sur l’EPA, le DHA et d’autres oxilipins libres sont essentielles pour clarifier ce point et sortent du cadre de l’application actuelle de la méthode.