بندقية الدهون من أنسجة القوارض
Summary
تقدم الدهون القائمة على قياس الطيف الكتلي للبندقية لقطة كمية حساسة لمجموعة واسعة من فئات الدهون في وقت واحد في قياس واحد من أنسجة القوارض المختلفة.
Abstract
تلعب الليبيدات دورا حيويا كمكونات أساسية لجميع الخلايا بدائية النواة وحقيقية النواة. جعلت التحسينات التكنولوجية المستمرة في قياس الطيف الكتلي من علم الدهون أداة تحليلية قوية لمراقبة تركيبات الدهون في الأنسجة في حالات الاستتباب وكذلك المرض. تقدم هذه الورقة بروتوكولا خطوة بخطوة لطريقة تحليل دهون البندقية التي تدعم الكشف المتزامن والقياس الكمي لبضع مئات من أنواع الدهون الجزيئية في عينات مختلفة من الأنسجة والسوائل الحيوية ذات الإنتاجية العالية. تستفيد هذه الطريقة من الحقن المباشر الآلي لتدفق النانو لمستخلص دهني كلي تم رفعه بمعايير داخلية موسومة دون فصل كروماتوغرافي في أداة قياس الطيف الكتلي عالية الدقة. بدءا من كميات أقل من ميكروغرام من أنسجة القوارض ، يستغرق تحليل MS 10 دقائق لكل عينة ويغطي ما يصل إلى 400 دهون من 14 فئة دهنية في أنسجة رئة الفئران. الطريقة المعروضة هنا مناسبة تماما لدراسة آليات المرض وتحديد وقياس المؤشرات الحيوية التي تشير إلى السمية المبكرة أو الآثار المفيدة داخل أنسجة القوارض.
Introduction
يعرف دخان السجائر (CS) بأنه عامل خطر رئيسي مرتبط بتطور الأمراض الالتهابية المزمنة في الرئة ، بما في ذلك سرطان الرئة والتهاب الشعب الهوائية ومرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)1. بالإضافة إلى تأثير الرئة ، يلعب التعرض ل CS دورا مهما في تطور أمراض أخرى مثل مرض الشريان التاجي تصلب الشرايين وأمراض الأوعية الدموية الطرفية1. أمراض القلب والأوعية الدموية ، جنبا إلى جنب مع مرض الانسداد الرئوي المزمن ، هي الأسباب الرئيسية الأولى والثالثة للوفاة في جميع أنحاء العالم ، على التوالي. اعتمدت نهج تقييم المخاطر السمية تاريخيا على استخدام النماذج الحيوانية مثل القوارض. في الجسم الحي ، تستخدم نماذج الفئران والفأر للأنف فقط أو الجسم بالكامل بشكل شائع لدراسة الآثار طويلة المدى للتعرض ل CS.
على سبيل المثال ، بشكل عام ، يؤدي التعرض للدخان لمدة 6 أشهر إلى حدوث تشوهات نسيجية ووظيفية في رئتي الفئران تحاكي تلك الخاصة بالأمراض البشرية ، بما في ذلك انتفاخ الرئة وإعادة تشكيل مجرى الهواء وارتفاع ضغط الدم الرئوي ، على الرغم من أن التغييرات خفيفة نسبيا مقارنة بتلك التي لوحظت في المدخنين البشريين على المدىالطويل 2. في كل من الأنسجة الحيوانية والبشرية ، لاحظت الدراسات مجموعة واسعة من التغيرات الجزيئية استجابة للتعرض ل CS ، بما في ذلك استجابات الإجهاد التأكسدي ، والالتهاب ، وتغيرات الأنسجة الهيكلية 3,4. ليس من المستغرب أن يكون للتعرض ل CS تأثير بعيد المدى على دهون الرئة ، بما في ذلك التأثيرات على الدهون الخافضة للتوتر السطحي ، ووسطاء إشارات الدهون ، والدهون الهيكلية4،5،6.
لتوصيف التغيرات في الدهون السائبة الناجمة عن التعرض طويل الأمد ل CS لرئتي الفأر ، أجرينا تحليلا سريعا وكميا لقياس الطيف الكتلي بالتسريب المباشر للبندقية. بعد إدخال طريقة الدهون في البندقية في 20057 ، تم استخدام هذه الطريقة بشكل فعال لتوسيع معرفتنا حول التمثيل الغذائي الخلوي للدهون8،9،10 في أنظمة نموذجية مثل الخميرة 11 ، Caenorhabditis elegans12 ، و Drosophila melanogaster13 ، وكذلك في مجموعة واسعة من أنواع عينات الثدييات مثل خطوط الخلايا 14 ، 15,16 مختلف الإنسان17,18 وأنسجة القوارض 19,20 وسوائل الجسم21,22.
على مدى العقود الماضية ، كشفت الدراسات عن تعقيد الاستجابات الخلوية للتغيرات البيئية ، والتي تشمل الآلاف من البروتينات والدهون والأيضات المترابطة. وقد أوضح ذلك أن استخدام أحدث التقنيات التحليلية أمر ضروري للحصول على رؤية متعمقة للآليات الجزيئية وللكشف عن الحجم الكامل للتأثيرات الفسيولوجية الخارجية. في هذا السياق ، يمكن أن تضيف بصمات الدهون الكمية الشاملة التي تنتجها مناهج الدهون في البندقية بشكل فعال إلى معرفتنا حول التمثيل الغذائي الخلوي للدهون8،9،10.
فيما يتعلق بالتعرض ل CS كعامل خطر للعديد من الأمراض ، اعتمدت مناهج تقييم المخاطر السمية تاريخيا على استخدام النماذج الحيوانية مثل القوارض. يوفر Shotgun lipidomics MS أداة تحليلية سريعة وحساسة وكمية لتقييم اضطراب الدهون في العديد من أنواع العينات. الميزة الفريدة لعلم الدهون في البندقية هي التحليل الآلي للحقن المباشر لمستخلص الدهون الكلي – المسنن بمعايير داخلية موسومة – بدون فصل كروماتوغرافي إلى أداة MS عالية الدقة باستخدام رقاقة نانوية موصلة تولد رذاذ نانوي بالتأين الكهربائي (ESI)23.
توفر معلومات نسبة الكتلة إلى الشحن التي يتم الحصول عليها في وقت واحد في وضع MS1 البصمة الدهنية الكلية لجميع الدهون الداخلية السليمة. اختياريا ، يوفر وضع MS2 / MS3 ، الذي يتم فيه تجزئة جزيئات الدهون الأصلية وتحليلها ، معلومات هيكلية إضافية. يتطلب تحليل البيانات برامج متخصصة ويتضمن فك التفاف الأطياف وتخصيصات الذروة في الأطياف المجمعة التي تؤدي إلى تحديد الدهون وتوضيح التركيب الكيميائي المفترض. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن إجراء القياس الكمي المطلق عن طريق رفع خليط المعايير الداخلية المسمى الذي يحتوي على معيار دهني واحد على الأقل لكل فئة دهنية ذات أهمية. بشكل عام ، مع التقنية الحالية ، يمكن أن يغطي تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد الذي يستغرق بضع دقائق لكل عينة تحديد وتقدير ما يصل إلى 800 دهون من 14 فئة دهنية24 في أنسجة القوارض.
Protocol
Representative Results
Discussion
على الرغم من أن التقدم في مرض التصلب العصبي المتعدد قد أسفر عن مجموعة متنوعة من الطرق لمراقبة العديد من أنواع الدهون بدقة ، إلا أن التنميط الدهني السابق لأنسجة الثدييات المختلفة لم يظهر نتائج متسقة ، وبالتالي ، لا تزال الوظائف الخاصة بالأنسجة للدهون غير واضحة. بالمقارنة مع التحليل الوظيفي للبروتين ، حيث تتوفر طرق أكثر قوة لضرب التعبير عن مركبات معينة ، لا يمكن إيقاف تشغيل غالبية الدهون بشكل انتقائي أو الإفراط في التعبير عنها في الأنسجة ، مما يجعل التقييم الوظيفي للدهون صعبا. قد يوفر التنميط المتقدم لتركيزات الدهون في الأنسجة نهجا بديلا لتحديد الارتباطات بين الدهون المنتشرة والأمراض البشرية.
عند تقييم طرق الدهون الشاملة القادرة على تغطية ملف الدهون الداخلي لأي نسيج فأر نوعيا وكميا، أعطينا الأفضلية لطريقة الدهون في البندقية. بشكل عام ، هناك نوعان متعاكسان من تحليل العينات: إما فحص غير مستهدف تماما للدهون باستخدام الفصل القائم على الكروماتوغرافيا السائلة (LC) مع مزيد من الكشف الطيفي الكتلي للكشف عن التعقيد الكلي للدهون في العينة ، أو الأساليب المستهدفة ، والتي تسمح في الغالب بقياس دقيق للغاية للدهون المحددة ذات الأهمية. في المقابل ، فإن الميزة القوية لسير عمل الدهون المقدمة هي التغطية الشاملة السريعة لمئات الدهون الداخلية من فئات الدهون المحددة مسبقا ، والتي لا يزال من الممكن إجراؤها بطريقة شبه كمية قوية.
تعتمد كفاءات التأين لفئات الدهون المختلفة على التركيب ويمكن أن تختلف اختلافا كبيرا اعتمادا على ظروف التأين التجريبية المختلفة. على عكس طرق الفصل القائمة على LC ، يقلل تحليل البندقية من هذه الاختلافات بسبب التسريب المتزامن المباشر لمستخلص الدهون بالكامل في ظل نفس ظروف التأين في أداة MS. يسمح استخدام نظائر الدهون الموسومة نظائريا أو المعايير غير الداخلية المماثلة هيكليا بالقياس شبه الكمي لجميع فئات الدهون. توفر دهون البندقية تباينا منخفضا بين وأثناء التشغيل أثناء تحليل مرض التصلب العصبي المتعدد. نتيجة لذلك ، تنتج هذه الطريقة معاملات تباين أقل21 من الطرق غير المستهدفة القائمة على الكروماتوغرافيا السائلة ، والتي تتطلب معايير متعددة للقياس الكمي الكافي. الأهم من ذلك ، على الرغم من عدم استخدام منحنى معايرة خارجي في الطريقة الحالية ، إلا أن الطريقة لا تزال تعتبر كميةبالكامل 32.
مستوى واحد من المعيار الداخلي المسمى (أو المعيار غير المسمى الذي لم يتم التعبير عنه داخليا) لكل فئة دهون يكفي لتحديد كمية معظم الدهون. أبلغ عدد قليل فقط من المنشورات عن التحقق من صحة الطريقة الجزئية لطريقة الدهون في البندقية. على سبيل المثال ، في Gryzbek et al.17 و Surma et al.21 ، تم إعداد منحنيات المعايرة المعكوسة باستخدام معايير داخلية وكمية ثابتة من مصفوفة العينة. تم تقييم الخطية من خلال الانحدار الخطي لكميات الدهون المحولة لوغاريتمية وكثافتها وتم الإبلاغ عنها على أنها R2 والمنحدر ، على التوالي. تم تحديد حد الكشف (LOD) وحد القياس الكمي (LOQ) من خلال الانحدار الخطي المرجح على أساس نسبة الإشارة إلى الضوضاء البالغة 3 ل LOD و 10 ل LOQ. بالنسبة لمعظم فئات الدهون ، تم تعريف LOQ بين 2-9.8 pmol للأنسجة الدهنية و 0.05-5μM في البلازما. في كلتا الحالتين ، تم استخدام معايير داخلية مفردة غير داخلية لكل فئة لاشتقاق تقديرات لجميع الدهون في الفئة. ومع ذلك ، في هذا العمل ، لا نقدم LOD / LOQ بسبب العديد من المخاوف: المصفوفة الداخلية ليست خالية من المركبات ، والمصفوفة البديلة للأنسجة غير متوفرة – مع هذا ، فإن ارتفاع كميات صغيرة معروفة من المعايير غير ممكن. نحن لا ننفذ نهج القياس الكمي المستهدف الكلاسيكي باستخدام سلسلة منحنى معايرة لمركب معين تم تطبيعه بواسطة معياره المطابق المسمى نظائريا بسبب عدم وجود معايير نقية والتوافر المحدود للغاية للدهون الموسومة نظائريا. تقوم كاشفات Orbitrap تلقائيا بتحويل الإشارة العابرة عن طريق تطبيق تحويل فورييه ، ويتم استبدال بعض الإشارات بالفعل – ونتيجة لذلك ، سيكون نطاق التركيز المنخفض خطيا فقط وصولا إلى بعض الإشارات الدنيا ، والتي لن يكون الجزيء قابلا للكشف عنها بعد الآن. تعتمد قيم إشارة إلى ضوضاء برنامج Xcalibur على نسبة m / z للجزيء ؛ نتيجة لذلك ، سيكون لمركبات كل فئة دهنية ، تحتوي على مجموعات مختلفة من الأحماض الدهنية ، قيم ضوضاء مختلفة. علاوة على ذلك ، ترتبط قيم LOQ / LOQ ارتباطا وثيقا بنوع المصفوفة ، وعندما يتم إجراء القياس الكمي للدهون في أنسجة القوارض المختلفة ، يجب أن ينعكس ذلك من خلال تقييم LOQs لكل نوع من الأنسجة على حدة.
في الواقع ، توفر الطريقة نطاقا كميا ديناميكيا خطيا عاليا يصل إلى أربعة أوامر من الحجم33 وحساسية جيدة جدا لتغطية أهم الدهون الهيكلية الداخلية ، والتي يمكن زيادتها بشكل أكبر من خلال التحسينات التقنية في اكتساب MS32. كانت معاملات الاختلاف في متوسط تركيزات الدهون في الغالب أقل من 15٪ ، مما يعني أن دهون البندقية تتوافق مع متطلبات إدارة الغذاء والدواء (FDA) كطريقة يجب مراعاتها للممارسة المختبرية الجيدة (GLP) والممارسة السريرية الجيدة (GCLP)دراسات 34.
ومع ذلك ، تجدر الإشارة إلى أنه بسبب قطبية مختلفة ، تصبح بعض فئات الدهون أكثر تأثرا بمساهمة FAs مترافقة محددة. وهذا يؤدي إلى تشويه في استجابة الشدة في المخاليط المتساوية المولية التي تحتوي على مجموعة واسعة من FAs المترافقة ، مما يؤدي إلى تحيز القياس الكمي ، كما أوضح Koivusalo et al.35 لفئات الفوسفوليبيد. وتجدر الإشارة إلى أن هؤلاء المؤلفين قدموا بيانات لمجموعة واسعة من FAs ، من 24-48 طول السلسلة ، والتي من المحتمل ألا تعكس الوضع في عينة بيولوجية حقيقية. كانت الاستجابة للأنواع المتعددة غير المشبعة أعلى بنسبة 40٪ من الأنواع المشبعة بالكامل ، ولكن لوحظ هذا التأثير فقط للتركيزات الأعلى. عندما تم تخفيف الخليط تدريجيا ، تضاءل تأثير عدم التشبع تدريجيا واختفى تقريبا عند 0.1 بمول / ميكرولتر لكل نوع. بالإضافة إلى ذلك ، تم إجراء جميع القياسات على أجهزة مصيدة الأيونات وأجهزة رباعية الأقطاب الثلاثية وليس على معدات Q-Exactive.
ميزة أخرى لسير العمل المقدم هي مرونته الفنية ، والتي تسمح بالتكيف مع متطلبات المشروع المحددة. على سبيل المثال ، يمكن استخدام أي بروتوكول لاستخراج الدهون – مثل طرق Bligh and Dyer36 المعدلة أو ميثيل ثلاثي بوتيلإيثر 37 أو بيوتانولميثانول 38 – لإعداد مستخلص دهني كلي قبل تحليل MS. القيد الرئيسي لاستخراج الكلوروفورم والميثانول هو أن المرحلة السفلى تحتوي على جزء الدهون ، مما يعقد العمل الروتيني وخاصة الأتمتة. بالإضافة إلى ذلك ، يجب النظر في سمية الكلوروفورم. يستخدم استخراج الأثير ثلاثي بوتيل على نطاق واسع لتحليل الدهون لعينات البلازما37 ، وقد تم اقتراح نسخة آلية21. في هذه الحالة ، اخترنا طريقة BUME لأنها توفر عمليات استرداد أفضل لفئات الدهون PG و PI و PA و PS38 ، واستهلاك أقل للمذيبات ، وإمكانية الأتمتة39 ، في حين أن التركيزات الإجمالية المحددة كميا لعينات الأنسجة المستخرجة من جميع الطرق الثلاث كانت قابلة للمقارنة. بالإضافة إلى ذلك ، بينما تم إجراء استخراج العينة يدويا في العمل الحالي ، من الممكن أيضا الحصول على نتائج دقيقة وقابلة للتكرار من مجموعات العينات الكبيرة عن طريق التحضير الآلي للعينات واستخراج الدهون بتنسيق 96 بئرا40,41. هذا يسمح للمرء بتنفيذ تحليل الدهون في الدراسات السريرية والسمية واسعة النطاق.
في العمل الحالي ، أجرينا اكتساب MS للأوضاع الإيجابية والسلبية بشكل منفصل دون تبديل القطبية كما هو موضح من قبل Schuhmann et al.42. يكون استقرار إشارة النانو أفضل في الوضع السلبي لمحلول أقل تركيزا قليلا منه في الوضع الإيجابي. بالإضافة إلى ذلك ، قمنا بتطوير إجراء يمكن تتبعه بالكامل باستخدام برنامج محول من ملفات .raw إلى mzML ، والذي يوفر القيم التي سيتم تحديدها في برنامج LipidXplorer – مع هذا ، لا يلزم إجراء حسابات منحدر الدقة اليدوية. قمنا أيضا بتطبيق بدائل مختلفة لإعداد الضوضاء لأنه في الوضع الإيجابي ، تكون مستويات ضوضاء الأطياف أعلى منها في الوضع السلبي. تم تحسين جميع الخطوات لإجراء تحليلات روتينية عالية الإنتاجية يمكن تتبعها.
لتحديد الهوية ، يمكن لتحليل الدهون في البندقية استغلال السلوك الفريد لفئات الدهون المختلفة ، والتي تشكل مواد مضافة فريدة في أوضاع قطبية مختلفة. في هذه الطريقة ، يمكن فصل أنواع PC و PE التي لها نفس الكتلة الجزيئية التي تتداخل في وضع التأين الإيجابي تماما في وضع التأين السلبي ، حيث يشكل PC أسيتات أو فورمات ، ويتأين PE في شكل منزوع البروتون. علاوة على ذلك ، فإن الالتفاف الهيكلي (الجزئي) ممكن للطريقة التي لا تستخدم فقط الصيغة الجزيئية ولكن أيضا بنية الأحماض الدهنية السائبة. على سبيل المثال ، يعمل تحديد FA على مستوى إجمالي الكربون وعدد إجمالي عدم التشبع لجميع الدهون الفوسفاتية و DAGs و TAGs و lyso-phospholipids. يمكن إجراء القياس الكمي من أسفل إلى أعلى لكل شكل إيزوميري جزئيا لبعض فئات الفوسفوليبيد43 ولكنه أكثر تعقيدا بالنسبة ل DAGs و TAGs بسبب استجابة الإشارة غير المتكافئة لمختلف FAs في أطياف MS2.
ومن المهم أيضا التأكيد على الحاجة إلى تنفيذ إجراءات مناسبة لمراقبة الجودة، تتماشى تماما مع المبادرات الأخيرة في هذا الميدان44. نظرا لأننا نرغب في ضمان إمكانية تتبع البيانات واستنساخها بشكل صحيح بين المختبر وداخله ، فقد تم اتخاذ عدد من الخطوات مثل التوزيع العشوائي المناسب للعينات لجميع خطوات التحليل ، والعمل مع الخلائط القياسية المعتمدة من المورد ، وإدراج عينات مراقبة الجودة ، وإجراءات التحقق من قبول الدفعات أو رفضها ، وإنشاء قاعدة بيانات داخلية لتتبع أداء مراقبة الجودة على المدى الطويل. كما تتسق مع هذه المبادرات الحاجة إلى طريقة موحدة لمعالجة استقرار العينة. بشكل عام ، لا تتأثر غالبية الليبيدات الهيكلية بأكسدة الليبيدات ، وهو أكثر صلة بالأوكسيليبينات والليبيدات المؤكسدة والأحماض الدهنية المتعددة غير المشبعة التي تكون بالتالي أكثر حساسية لظروف التخزين والمناولة. ومع ذلك ، لا يزال التقييم الصحيح لاستقرار العينة مهمة صعبة من الناحية الفنية.
ومع ذلك ، فإن هذا البروتوكول له قيود عندما يتعلق الأمر بتحديد المستويات دون الجزيئية للمركبات. بالنظر إلى أنه لا يوجد فصل للمستخلص الكلي ، يتم دمج جميع أشكال متساوية من الدهون التي لها نفس الكتلة الجزيئية ولكن تركيبات الأحماض الدهنية المختلفة في تحليل MS. بالنسبة لمعظم الفئات ، من الممكن تحقيق فك جزئي للهيكل باستخدام نسب تجزئة شظايا الأحماض الدهنية المتبقية في MS2. ومع ذلك ، لا يزال القياس الكمي المستقل لكل شكل متساوي الشكل مهمة صعبة بشكل خاص بسبب الاختلافات الكبيرة في سلوكيات التجزئة لمختلف الأشكال المتساوية وحقيقة أن المعايير الكيميائية النقية غير متوفرة في مجموعة كبيرة بما يكفي لتحديد قيم التعويض. هناك قيد آخر هو أن عملية ESI تولد حتما قطعا أثرية ، مما يؤدي إلى توليد قمم اصطناعية لبعض الدهون مثل DAGs و Pas و FAs ، مما قد يؤدي إلى تقدير كمي خاطئ.
بعد ذلك ، نلخص الأجزاء الأكثر أهمية في البروتوكول بناء على تجربتنا. الأول يتعلق بحقيقة أن كل نوع من أنواع أنسجة الفئران له ملف تعريف دهني فريد من حيث كل من كمية الدهون ونسب الطبقة. مع هذا ، يجب تحديد كميات البدء من الأنسجة بناء على محتوى البروتين الكلي قبل الاستخراج بعناية حتى لا تشبع إشارة MS وعدم ترك نطاق القياس الكمي الديناميكي بسبب تراكم الدهون بتركيزات عالية33 أو – في الطرف المعاكس – لتوفير إشارة MS كافية لتغطية مركبات الدهون الرئيسية لكل فئة دهنية.
الجانب الثاني الحاسم هو ضمان المحاذاة الصحيحة لموضع منفذ رقاقة مصدر النانو بالتسريب المباشر مع شعرية النقل لمطياف الكتلة. بالنظر إلى أن المعايرة الكاملة لمطياف الكتلة في كلا الوضعين يتم إجراؤها أسبوعيا ، فإن التبديل بين مصدر المعايرة وإعداد رقاقة مصدر النانو يمكن أن يكون سبب التباين الكبير في شدة الإشارة بسبب عدم المحاذاة أثناء التثبيت.
جزء آخر مهم من البروتوكول هو التعامل الدقيق مع مزيج المعايير الداخلية. نظرا لأن هذا الخليط يحتوي على كمية كبيرة من ثنائي كلورو ميثان ، بمجرد فتحه ، يجب استهلاكه بسرعة لتجنب التخزين الطويل والاستخدامات المتعددة التي تؤدي إلى التبخر وتغيير التركيز الاصطناعي. علاوة على ذلك ، فإن المعالجة المتسقة للخليط القياسي بعد الإزالة من التخزين -20 درجة مئوية أمر مهم ، لأن الاختلافات في درجات الحرارة يمكن أن تؤدي إلى عدم تناسق الحجم أثناء السحب باستخدام ماصات وسادة الهواء. يتمثل أحد الخيارات في استبدال ثنائي كلورو الميثان في المخزن المؤقت القياسي لإعادة التعليق بالميثانول النقي ، مما قد يحسن راحة المناولة ولكنه قد يؤثر سلبا على قابلية ذوبان بعض فئات الدهون ، وبالتالي يقلل من دقة القياس الكمي لفئات الدهون هذه.
الجزء الأخير الحاسم هو معالجة البيانات. يجمع سير عمل معالجة البيانات بين تحويل برنامج Peak by Peak من تنسيق .raw إلى تنسيق .mzML ، وتطبيق متوسط فحص MS2 وترشيح الضوضاء MS1 و MS2 ، بالإضافة إلى انتقاء الذروة وضغط البيانات. كبديل ، يمكن أيضا استخدام برنامج Proteowizard لتحويل البيانات ، ولكن في هذه الحالة ، يجب تحديد العديد من الإعدادات في LipidXplorer يدويا. يتركز كل تعقيد علم الدهون في البندقية بشكل خاص على خطوة إزالة الالتفاف لأطياف الحقن المباشر MS1 و MS2. يستورد برنامج LipidXplorer مفتوح المصدر الأطياف المحولة من تنسيق ملف mzML بناء على دقة الكتلة ودقة الكتلة وميل تغييرها مع زيادة m / z. يدمج البرنامج العديد من أطياف MS و MS / MS الفردية المكتسبة ضمن عملية التحليل. بعد ذلك ، يقوم بمحاذاة القمم الفردية داخل عمليات تشغيل عينات مختلفة ، وفي كل مجموعة من القمم المحاذية ، يستبدل كتلها بمتوسط كتلتها المرجح بالشدة الفردية ، بينما تظل وفرتها في كل ملف بيانات كما هي. يتم تخزين الكتل التمثيلية لمجموعات الذروة المحاذاة وكثافة الذروة الفردية في قاعدة بيانات المسح الرئيسي. تحتوي قاعدة بيانات المسح الرئيسي على جميع أطياف MS1 و MS2 التي تم إنشاؤها لجميع العينات في الدفعة ويمكن فك تجميعها إلى تعريفات الدهون عن طريق الاستعلامات المكتوبة بلغة استعلام التجزئة الجزيئية (MFQL).
بشكل عام ، تغطي الطريقة تحديد دهون DAG و TAG و SE بناء على الوضع الإيجابي ودهون PC و PE و PS و PI و PA و PG و SM و LPC و LPE بناء على اكتساب الوضع السلبي. أثناء تحديد الدهون ، يتم إجراء تصحيح النظائر ل MS1 و MS2 ، ويتم الإبلاغ عن الشدة المعدلة في ملف إخراج .xlsx. بدلا من ذلك ، تتوفر العديد من البرامج الأخرى لمعالجة بيانات البندقية ، مثل ALEX45 و LipidHunter46.
يتم تخزين الأحماض الدهنية – مكونات الأغشية النووية والخلوية الرئيسية – في شكل فوسفوليبيدات لمزيد من التحويل إلى جزيئات نشطة بيولوجيا. يمكن تحويلها بواسطة إنزيمات أسيلترانسفيراز الليزوفوسفوليبيد إلى ليسوفوسفوليبيدات من خلال مسار الأراضي47. من المعروف أن إنزيم LPCAT3 ، على سبيل المثال ، يظهر خصوصية عالية لدمج AA في وسيطة ليسوفوسفاتيديل كولين وليسوفوسفاتيديل سيرين. تم الإبلاغ عن التعبير العالي نسبيا لهذه الإنزيمات داخل الخلايا الالتهابية ، مثل الضامة السنخية والخلايا الظهارية القصبية47 ، مما أدى إلى إطلاق نسب نسبية أكبر من الدهون الفوسفاتية المحتوية على AA في تلك الخلايا. ومع ذلك ، بعد تحريرها من الدهون الفوسفاتية الغشائية بواسطة الفوسفوليباز A2 ، يتم تحفيز تحويل PUFAs إلى أنواع مختلفة من وسطاء الدهون بواسطة العديد من الإنزيمات48. علاوة على ذلك ، يمكن أن تصبح هذه PUFAs الركيزة لإنتاج البروستاجلاندين المؤيد للالتهابات والمضادة للالتهابات عن طريق عمل إنزيمات الأكسدة الحلقية (COX) -1 و COX-247. الفوسفوليبيدات هي أحد مصادر وسطاء الدهون التي يتم إطلاقها في مواقع معينة حيث يطلب من هؤلاء الوسطاء إظهار تأثيراتهم البيولوجية.
الرئة هي عضو معقد يضم أنواعا متعددة من الخلايا ، يلعب كل منها أدوارا متداخلة ومتخصصة في تسهيل نمو الرئة الطبيعي ووظيفته. تم إجراء عدد قليل فقط من الدراسات لعزل وتمييز أنواع مختلفة من الخلايا في الفأر أو الرئة البشرية (على سبيل المثال ، الخلايا السنخية من النوع 2)49,50 ؛ لم يتم تمييز أنواع خلايا الرئة الرئيسية الأخرى. أجريت دراسة أخرى مثيرة للاهتمام51 لعزل وإجراء تحليل الدهون للخلايا المناعية البطانية والظهارية والوسيطة والمختلطة في رئة الفأر. لوحظ أن تركيز PUFAs المدمجة في PCO و PG تم إثراؤه في الخلايا المناعية. بالنظر إلى حقيقة أن CS يحفز زيادة في الخلايا المناعية داخل الرئة (4-5 أضعاف) ، كما تم تقييمه بواسطة غسل القصبات الهوائية (BAL) 52 ، يمكن تفسير التغيرات الكلية في الدهون التي لوحظت في هذه الدراسة من خلال الزيادة التراكمية في تجنيد الخلايا المناعية في رئة الفأر.
في الختام ، يمكن أن يعكس التشويه الملحوظ للأحماض الدهنية الأحادية غير المشبعة و PUFAs المدمجة في الدهون الفوسفاتية زيادة بعض FAs داخل الخلية و / أو تشكل موردا داخل الخلايا من سلائف الأوكسيليبين التي يتم إنتاجها بشكل مفرط تحت الإجهاد التأكسدي والظروف الالتهابية. ومع ذلك ، فإن البيانات الإضافية حول EPA و DHA و oxilipins الأخرى ضرورية لتوضيح هذه النقطة وهي خارج نطاق تطبيق الطريقة الحالية.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
يود المؤلفون أن يشكروا فريق الدراسة ويقدروا بشكل خاص المساعدة الفنية والدعم المقدم من فرق البحث الحيوي والهباء الجوي في PMI R&D ، مختبرات فيليب موريس الدولية للأبحاث Pte. المحدودة، سنغافورة، وشركة فيليب موريس موريس برودكتس إس إيه، نوشاتيل، سويسرا. يشكر المؤلفون سام أنصاري على إدارته للبنوك الحيوية ويقرون بدعم Sindhoora Bhargavi Gopala Reddy لتحرير مسودة المخطوطة.
Materials
| 1, 5, and 2 mL self-lock tubes | Eppendorf | 30120086, 30120094 | |
| 3 mm stainless still beads | Qiagen | 69997 | |
| 4.1 µm nozzle chip | Advion | HD-D-384 | |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 45754-100ML-F | |
| Ammonium acetate | Honeywell | 14267-25G | |
| Ammonium bicarbonate | Sigma Aldrich | 09830-500G | |
| Bovine serum albumin standard, 2 mg/mL | Thermo Scientific | 23209 | |
| Butanol | Honeywell | 33065-2.5L | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 650498-1L | |
| Dichloromethane | Honeywell | 34856-1L | |
| Ethyl acetate | Honeywell | 33211 | |
| Greiner CELLSTAR 96 well plates | Sigma | M9686 | |
| Heptane | Sigma Aldrich | 34873-2.5L | |
| Isopropanol | Fisher Scientific | A461 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A456 | |
| Mouse pooled plasma | BioIvt | ||
| Mouse SPLASH standard | Avanti Polar Lipids | 330710X | Internal standard |
| Nunc 96-flat bottom well transparent plates | VWR | 62409-068 | |
| Plastic spatula | Sigma | Z560049-300EA | |
| Quick Start Bradford 1x Dye reagent | BioRad | 5000205 | |
| Serum diluent | Sigma Aldrich | D5197 | |
| Equipment/software | |||
| CryoPrep CP02 impactor instrument | Covaris | Magnetic hammer | |
| Centrifuge 5427R | Eppendorf | . | Centrifuge |
| ChipSoft 8.3 | Advion Biosciences | . | Software to set up method and acquisition on the Triversa nanomate robot |
| LipidXplorer 1.2.8.1 | N/A | . | Software to identify lipids |
| Peak By Peak | SpectroSwiss | . | Software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| ProteoWizard | ProteoWizard | . | Alternative (open source) software to convert .raw data from MS to .mzml format |
| Q-Exactive MS | Thermo Fisher | . | High resolution orbitrap mass spectrometer |
| Qiagen Tissue Lyser II | Qiagen | . | Tissue lyser |
| SpeedVac SPD140DDA | Thermo Fisher | . | Vacuum concentrator |
| Tecan Infinite M nano plus | Tecan | . | Plate reader |
| ThermoMixer C | Eppendorf | . | Thermomixer |
| TriVersa Nanomate | Advion Biosciences | . | Direct infusion nano-source |
| Xcalibur 4.3 | Thermo Scientific | . | Software to set up method and acquisition on the Q-Exactive MS |
Referências
- Salehi, N., Janjani, P., Tadbiri, H., Rozbahani, M., Jalilian, M. Effect of cigarette smoking on coronary arteries and pattern and severity of coronary artery disease: A review. Journal of International Medical Research. 49 (12), 3000605211059893 (2021).
- Churg, A., Sin, D. D., Wright, J. L. Everything prevents emphysema: Are animal models of cigarette smoke-induced chronic obstructive pulmonary disease any use. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 45 (6), 1111-1115 (2011).
- Lee, G., Walser, T. C., Dubinett, S. M. Chronic inflammation, chronic obstructive pulmonary disease, and lung cancer. Current Opinion in Pulmonary Medicine. 15 (4), 303-307 (2009).
- Titz, B., et al. Effects of cigarette smoke, cessation, and switching to two heat-not-burn tobacco products on lung lipid metabolism in C57BL/6 and Apoe-/- mice-An integrative systems toxicology analysis. Toxicological Sciences. 149 (2), 441-457 (2016).
- Morissette, M. C., Shen, P., Thayaparan, D., Stampfli, M. R. Disruption of pulmonary lipid homeostasis drives cigarette smoke-induced lung inflammation in mice. European Respiratory Journal. 46 (5), 1451-1460 (2015).
- Jubinville, E., et al. Interplay between cigarette smoking and pulmonary reverse lipid transport. European Respiratory Journal. 50 (3), 1700681 (2017).
- Han, X., Gross, R. W. Shotgun lipidomics: Electrospray ionization mass spectrometric analysis and quantitation of cellular lipidomes directly from crude extracts of biological samples. Mass Spectrometry Reviews. 24 (3), 367-412 (2005).
- Titz, B., et al. Multi-omics systems toxicology study of mouse lung assessing the effects of aerosols from two heat-not-burn tobacco products and cigarette smoke. Computational and Structural Biotechnology Journal. 18, 1056-1073 (2020).
- Hartung, T., et al. Systems toxicology: Real world applications and opportunities. Chemical Research in Toxicology. 30 (4), 870-882 (2017).
- Talikka, M., et al., Lyubimov, A., et al. Systems Toxicology. Encyclopedia of Drug Metabolism and Interactions. , (2016).
- Ejsing, C. S., et al. Global analysis of the yeast lipidome by quantitative shotgun mass spectrometry. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (7), 2136-2141 (2009).
- Papan, C., et al. Systematic screening for novel lipids by shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 86 (5), 2703-2710 (2014).
- Carvalho, M., et al. Effects of diet and development on the Drosophila lipidome. Molecular Systems Biology. 8, 600 (2012).
- Strittmatter, N., et al. Shotgun lipidomic profiling of the NCI60 cell line panel using rapid evaporative ionization mass spectrometry. Analytical Chemistry. 88 (15), 7507-7514 (2016).
- Lydic, T. A., et al. Rapid and comprehensive ‘shotgun’ lipidome profiling of colorectal cancer cell derived exosomes. Methods. 87, 83-95 (2015).
- Sampaio, J. L., et al. Membrane lipidome of an epithelial cell line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (5), 1903-1907 (2011).
- Grzybek, M., et al. Comprehensive and quantitative analysis of white and brown adipose tissue by shotgun lipidomics. Molecular Metabolism. 22, 12-20 (2019).
- Stegemann, C., et al. Comparative lipidomics profiling of human atherosclerotic plaques. Circulation: Cardiovascular Genetics. 4 (3), 232-242 (2011).
- Tajima, Y., et al. Lipidomic analysis of brain tissues and plasma in a mouse model expressing mutated human amyloid precursor protein/tau for Alzheimer’s disease. Lipids in Health and Disease. 12, 68 (2013).
- Gross, R. W., Han, X. Shotgun lipidomics of neutral lipids as an enabling technology for elucidation of lipid-related diseases. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism. 297 (2), 297-303 (2009).
- Surma, M. A., et al. An automated shotgun lipidomics platform for high throughput, comprehensive, and quantitative analysis of blood plasma intact lipids. European Journal of Lipid Science and Technology. 117 (10), 1540-1549 (2015).
- Heiskanen, L. A., Suoniemi, M., Ta, H. X., Tarasov, K., Ekroos, K. Long-term performance and stability of molecular shotgun lipidomic analysis of human plasma samples. Analytical Chemistry. 85 (18), 8757-8763 (2013).
- Zhang, S., Van Pelt, C. K. Chip-based nanoelectrospray mass spectrometry for protein characterization. Expert Review of Proteomics. 1 (4), 449-468 (2004).
- Surma, M. A., et al. Mouse lipidomics reveals inherent flexibility of a mammalian lipidome. Scientific Reports. 11 (1), 19364 (2021).
- Herzog, R., Schwudke, D., Shevchenko, A. LipidXplorer: Software for quantitative shotgun lipidomics compatible with multiple mass spectrometry platforms. Current Protocols in Bioinformatics. 43, 11-30 (2013).
- R: A language and environment for statistical computing. R: Foundation for Statistical Computing Available from: https://www.R-project.org/ (2018)
- Phillips, B., et al. A 7-month cigarette smoke inhalation study in C57BL/6 mice demonstrates reduced lung inflammation and emphysema following smoking cessation or aerosol exposure from a prototypic modified risk tobacco product. Food and Chemical Toxicology. 80, 328-345 (2015).
- Phillips, B., et al. A six-month systems toxicology inhalation/cessation study in ApoE(-/-) mice to investigate cardiovascular and respiratory exposure effects of modified risk tobacco products, CHTP 1.2 and THS 2.2, compared with conventional cigarettes. Food and Chemical Toxicology. 126, 113-141 (2019).
- Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C. Electrospray ionization tandem mass spectrometry of glycerophosphoethanolamine plasmalogen phospholipids. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 15 (10), 1499-1508 (2004).
- Engelmann, B. Plasmalogens: Targets for oxidants and major lipophilic antioxidants. Biochemical Society Transactions. 32, 147-150 (2004).
- Nagan, N., Zoeller, R. A. Plasmalogens: Biosynthesis and functions. Progress in Lipid Research. 40 (3), 199-229 (2001).
- Southam, A. D., Weber, R. J., Engel, J., Jones, M. R., Viant, M. R. A complete workflow for high-resolution spectral-stitching nanoelectrospray direct-infusion mass-spectrometry-based metabolomics and lipidomics. Nature Protocols. 12 (2), 310-328 (2016).
- Yang, K., Han, X. Accurate quantification of lipid species by electrospray ionization mass spectrometry – Meet a key challenge in lipidomics. Metabolites. 1 (1), 21-40 (2011).
- Zullig, T., Trotzmuller, M., Kofeler, H. C. Lipidomics from sample preparation to data analysis: a primer. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 412 (10), 2191-2209 (2020).
- Koivusalo, M., Haimi, P., Heikinheimo, L., Kostiainen, R., Somerharju, P. Quantitative determination of phospholipid compositions by ESI-MS: Effects of acyl chain length, unsaturation, and lipid concentration on instrument response. Journal of Lipid Research. 42 (4), 663-672 (2001).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A rapid method of total lipid extraction and purification. Canadian Journal of Biochemistry and Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Matyash, V., Liebisch, G., Kurzchalia, T. V., Shevchenko, A., Schwudke, D. Lipid extraction by methyl-tert-butyl ether for high-throughput lipidomics. Journal of Lipid Research. 49 (5), 1137-1146 (2008).
- Lofgren, L., Forsberg, G. B., Stahlman, M. The BUME method: A new rapid and simple chloroform-free method for total lipid extraction of animal tissue. Scientific Reports. 6, 27688 (2016).
- Lofgren, L., et al. The BUME method: A novel automated chloroform-free 96-well total lipid extraction method for blood plasma. Journal of Lipid Research. 53 (8), 1690-1700 (2012).
- Jung, H. R., et al. High throughput quantitative molecular lipidomics. Biochimica et Biophysica Acta. 1811 (11), 925-934 (2011).
- Lavrynenko, O., et al. Ceramide ratios are affected by cigarette smoke but not heat-not-burn or e-vapor aerosols across four independent mouse studies. Life Sciences. 263, 118753 (2020).
- Schuhmann, K., et al. Shotgun lipidomics on a LTQ Orbitrap mass spectrometer by successive switching between acquisition polarity modes. Journal of Mass Spectrometry. 47 (1), 96-104 (2012).
- Schuhmann, K., et al. Quantitative fragmentation model for bottom-up shotgun lipidomics. Analytical Chemistry. 91 (18), 12085-12093 (2019).
- Lipidomics Standards Initiative Consortium. Lipidomics needs more standardization. Nature Metabolism. 1 (8), 745-747 (2019).
- Husen, P., et al. Analysis of lipid experiments (ALEX): A software framework for analysis of high-resolution shotgun lipidomics data. PloS One. 8 (11), 79736 (2013).
- Ni, Z., Angelidou, G., Lange, M., Hoffmann, R., Fedorova, M. LipidHunter identifies phospholipids by high-throughput processing of LC-MS and shotgun lipidomics datasets. Analytical Chemistry. 89 (17), 8800-8807 (2017).
- Zemski Berry, K. A., Murphy, R. C., Kosmider, B., Mason, R. J. Lipidomic characterization and localization of phospholipids in the human lung. Journal of Lipid Research. 58 (5), 926-933 (2017).
- Ghosh, M., Tucker, D. E., Burchett, S. A., Leslie, C. C. Properties of the Group IV phospholipase A2 family. Progress in Lipid Research. 45 (6), 487-510 (2006).
- Besnard, V., et al. Deletion of Scap in alveolar type II cells influences lung lipid homeostasis and identifies a compensatory role for pulmonary lipofibroblasts. Journal of Biological Chemistry. 284 (6), 4018-4030 (2009).
- Plantier, L., et al. Activation of sterol-response element-binding proteins (SREBP) in alveolar type II cells enhances lipogenesis causing pulmonary lipotoxicity. Journal of Biological Chemistry. 287 (13), 10099-10114 (2012).
- Kyle, J. E., et al. Cell type-resolved human lung lipidome reveals cellular cooperation in lung function. Scientific Reports. 8 (1), 13455 (2018).
- Lugg, S. T., Scott, A., Parekh, D., Naidu, B., Thickett, D. R. Cigarette smoke exposure and alveolar macrophages: mechanisms for lung disease. Thorax. 77 (1), 94-101 (2022).
