Vi beskriver en protokol for isolering af mesenkymale stamceller fra humant navlesnorsvæv og deres differentiering i skeletmuskelslægten.
Udforskning af det terapeutiske potentiale af mesenkymale stamceller er betinget af den lette isolering, styrke mod differentiering og kildens pålidelighed og robusthed. Vi beskriver her en trinvis protokol til isolering af mesenkymale stamceller fra humant navlesnorsvæv (UMSC’er), deres immunophenotyping og formering af sådanne kulturer over flere passager. I denne procedure er levedygtigheden af uMSC’erne høj, fordi der ikke er nogen enzymatisk fordøjelse. Endvidere sikrer fjernelsen af blodkar, herunder navlestrengsarterierne og venen, at der ikke er nogen forurening af celler af endoteloprindelse. Ved anvendelse af flowcytometri er uMSC’er ved isolering CD45-CD34–, hvilket indikerer et fravær af celler fra den hæmatopoietiske afstamning. Det er vigtigt, at de udtrykker vigtige overflademarkører, CD105, CD90 og CD73. Ved etablering af kulturer beskriver dette papir en effektiv metode til at inducere differentiering i disse uMSC’er i skeletmuskelslægten. En detaljeret analyse af myogen progression i differentierede uMSC’er afslører, at uMSC’er udtrykker Pax7, en markør for myogene forfædre i de indledende stadier af differentiering, efterfulgt af ekspressionen af MyoD og Myf5, og endelig en terminal differentieringsmarkør, myosin tung kæde (MyHC).
Den menneskelige navlestreng er blevet krediteret for at have et robust reservoir af mesenkymale stamceller, som i øjeblikket undersøges til regenerative terapier på grund af deres robuste proliferations- og differentieringshastigheder, immunmodulerende egenskaber og evne til at generere celler fra alle de tre kimlag1. Navlestrengsvævet består af flere rum såsom navlesnorsblodet, navlestrengsunderendotelet og Whartons gelé (WJ), som i sig selv omfatter tre utydelige regioner – den perivaskulære zone, den intervaskulære zone og underamnionen eller ledningsforingen (CL)2. Mens uMSC’er kan isoleres fra alle disse forskellige regioner og bredt udtrykke vigtige MSC-markører, er der ingen klarhed over, om disse rum indeholder den samme population af uMSC’er eller viser forskelle i deres differentieringsstyrker3. Derfor kræver protokoller til isolering af uMSC’er en større præcision i deres isolationstilstand og -region, den robuste karakterisering af differentieringspotentialer og endelig en sammenlignende analyse fra forskellige rum i ledningen.
I denne sammenhæng har få undersøgelser vist forskelle i uMSC proliferative og differentiative potentialer mellem forskellige dele af ledningen. Af disse afslørede sammenlignende analyser mellem uMSC’er isoleret fra CL- og WJ-regionerne et større proliferativt potentiale i CL-afledte uMSC’er 3,4. I en separat undersøgelse klarede WJ-afledte uMSC’er sig bedre i proliferationsassays sammenlignet med perivaskulære celler (HUCPV)5. Ved undersøgelse af forskelle mellem navlestrengsblodafledte uMSC’er og navlestrengsvævsafledte uMSC’er uden vaskulær kontaminering blev der rapporteret differentiel ekspression af vigtige MSC-markører mellem de to rum samt øgede proliferationshastigheder i navlestrengsvævsafledte uMSC’er6.
Af de mange undersøgelser, der undersøgte differentieringspotentialerne for uMSC’er primært i væv af mesoderm-slægten, såsom osteoogene, adipogene og kondrogogene afstamninger, har meget få givet detaljerede protokoller for myogen differentiering og efterfølgende karakterisering samt sammenlignende analyser mellem forskellige ledningsrum. I denne sammenhæng har vi udviklet en robust muskeldifferentieringsprotokol og observeret, at navlestrengsvævsafledte uMSC’er viser overlegne myogene differentieringsevner sammenlignet med navlestrengsblod6. Her er en trinvis protokol detaljeret til isolering af uMSC’er fra hele ledningsvævet uden celler forbundet med vaskulaturen, deres karakterisering og deres differentiering i den myogene afstamning.
Kritiske trin
Et kritisk trin i denne protokol er indsamling af væv under aseptiske forhold, fra leveringstidspunktet til vedligeholdelse af sterile kulturer, i hele formeringsvarigheden. Under ledningsopsamling er det vigtigt, at ledningen ikke rører nogen ikke-steriliseret overflade og podes eksternt med 70% ethanol inden opsamling i rør indeholdende PBS suppleret med antibiotika. Det er vigtigt at begrænse tiden mellem ledningsopsamling og behandling af vævet til uMSC-isolering. Hvis der er be…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Mr. Ojas Tikoo for deres hjælp med filmoptagelse og videoproduktion. Vi anerkender også den hjælp, der er modtaget fra GARBH-Ini (Interdisciplinary Group on Advanced Research and Birth Outcome-DBT India) personale, sygeplejersker og seniorforskningsofficerer på Gurugram Civil Hospital og Dr. Pallavi Kshetrapal til hjælp med logistik. Dette arbejde blev støttet af tilskud tildelt Suchitra Gopinath fra Institut for Bioteknologi, Indien (BT/09/IYBA/2015; BT/PR29599/PFN/20/1393/2018).
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
Amphotericin B | Sigma Aldrich | A2411 | |
Antibiotic solution 100x Liquid, endotoxin tested (10,000 U Penicillin and 10 mg Streptomycin/mL in 0.9% normal saline) | HiMedia | A001A-50mL | |
Anti-GAPDH antibody | Sigma Aldrich | G8795 | |
Anti-MyHC antibody (My32) | Novus Biologicals | NBP2-50401AF647 | |
Anti-MyoD antibody (5.8A) | Novus Biologicals | NB100-56511 | |
Anti-Myogenin antibody (Clone F5D) | Novus Biologicals | NBP2-34616AF594 | |
Anti-Pax7 antibody | DSHB | DSHB-C1-576 | |
APC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 559869 | |
Collagen Type 1 | Merck | C8919 | |
D (+) Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
Dexamethasone | SIGMA | D4902 | |
FACSCanto II or FACSAria III | BD Biosciences | ||
Fetal Bovine Serum, qualified Brazil | GIBCO | 10270106 | not to be heat-inactivated |
FITC Mouse anti-human CD106 clone 51-10C9 | BD Biosciences | 551146 | |
FITC Mouse anti-human CD14 clone M5E2 | BD Biosciences | 557153 | |
FITC Mouse anti-human CD31 clone WM59 | BD Biosciences | 557508 | |
FITC Mouse anti-human CD34 clone 581 | BD Biosciences | 555821 | |
FITC Mouse anti-human CD45 clone HI30 | BD Biosciences | 555482 | |
FITC Mouse anti-human CD49D clone 9F10 | BD Biosciences | 560840 | |
FITC Mouse anti-human CD90 clone 5E10 | BD Biosciences | 555595 | |
FITC Mouse anti-human HLA-A,B,C clone G46-2.6 | BD Biosciences | 557348 | |
FITC Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555786 | |
FlowJo software | BD Biosciences | ||
Gentamicin | Sigma Aldrich | G1264 | |
Horse serum | HiMedia | RM1239 | |
Hydrocortisone | Merck | H4001 | |
Laminin | Merck | L2020 | |
MEM Alpha Modification without L-glutamine, ribo- and deoxyribonucleosides | Hyclone | SH30568.FS | Basal medium for uMSCs |
PE Mouse anti-human CD105 clone 266 | BD Biosciences | 560839 | |
PE Mouse anti-human CD44 clone 515 | BD Biosciences | 550989 | |
PE Mouse anti-human CD49E clone llA1 | BD Biosciences | 555617 | |
PE Mouse anti-human IgG clone G18-145 | BD Biosciences | 555787 | |
PE-Cy7 Mouse anti-human CD73 CLONE AD2 | BD Biosciences | 561258 | |
Phosphate buffered saline (PBS), pH=7.4 | HiMedia | M1866 | |
Trypsin/EDTA solution (1x 0.25% Trypsin and 0.02% EDTA in Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) | HiMedia | TCL049-100mL |