L’incisive de souris en croissance continue est un excellent modèle pour étudier les cellules souches adultes¹. Les cellules souches épithéliales (boucle cervicale labiale et linguale) et mésenchymateuses (entre la boucle cervicale labiale et linguale) qui résident sur la face proximale de l’incisive se différencient en améloblastes, odontoblastes et cellules pulpaires dentaires. Ce processus unique fournit une source de cellules pour compenser la perte tissulaire et le renouvellement². Bien que plusieurs marqueurs de cellules souches tels que Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, etc. ont été identifiés in vivo pour les sous-ensembles de cellules souches adultes dans des incisives de souris, ils sont inadéquats pour représenter les populations de cellules souches lorsqu’ils sont utilisés seuls 1,3,4,5. La visualisation de cellules quiescentes à longue durée de vie par marquage et rétention d’ADN analogue nucléotidique pourrait fournir une détection impartiale pour la plupart des sous-ensembles de cellules souches adultes⁶. De plus, cette approche est utile parmi de nombreuses méthodes d’identification des cellules souches⁷ pour comprendre le comportement cellulaire et l’homéostasie des populations de cellules souches dentaires ^3,8. Alors que les cellules souches en division perdraient leur marquage ADN après une poursuite considérable, les cellules souches supposées quiescentes conservent leur marquage ADN, les considérant comme des cellules retenant le marquage (LRC)⁶. Le marquage et la rétention de l’ADN par des cellules souches non divisées marqueront et localiseront les cellules souches adultes présumées dans leurs niches.

Au cours des dernières années, le marquage analogue de la 5-bromo-2′-désoxyuridine (BrdU) analogue à la thymidine a remplacé la méthode de marquage de l’ADN 3H-thymidine incompatible, fastidieuse, longue et à haute résolution, pour les tests de prolifération cellulaire ^6,9. Ces dernières années, la technique de marquage de la 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) a été de plus en plus utilisée par rapport au BrdU. Cette tendance est apparue pour plusieurs raisons. Premièrement, la méthode BrdU est lente et nécessite beaucoup de main-d’œuvre. Les conditions de l’utilisateur sont variables et il est incapable de préserver l’ultrastructure des échantillons (en raison de la dénaturation de l’ADN). De même, la méthode BrdU perd l’antigénicité des cellules, ce qui la rend inefficace pour les analyses fonctionnelles en aval et les essais tels que les expériences de colocalisation et la transplantation in vivo de cellules souches 3,7,9,10,11,12. BrdU est également un tératogène, qui ne convient pas pour étiqueter les CRL dans le développement embryonnaire⁶. En outre, la méthode BrdU est inefficace lorsqu’elle est utilisée dans les spécimens à montage entier. Les inconvénients sont une faible pénétration des anticorps dans la partie profonde des échantillons ou la nécessité d’une longue période d’incubation des anticorps pour une pénétration profonde¹³. Le marquage EdU échappe aux étapes de dénaturation des échantillons, préservant ainsi l’ultrastructure. Cette caractéristique est avantageuse pour les analyses fonctionnelles en aval telles que les expériences de colocalisation et la transplantation de cellules souches^11,12. De plus, l’étiquetage EdU est très sensible et rapide; La pénétration des échantillons est élevée en raison de l’utilisation d’azotures fluorescents rapidement absorbés et de plus petite taille pour détecter les marqueurs EdU par une réaction de cycloaddition catalysée par Cu(I [3 + 2] (chimie « clic »)¹⁴.

Une autre méthode de marquage ADN de plus en plus appliquée est l’utilisation de souris transgéniques modifiées. Ces souris expriment la protéine fluorescente verte histone 2B (H2B-GFP) contrôlée par un élément régulateur sensible à la tétracycline ^5,14. Après avoir nourri des souris avec de la tétracycline chow/eau pendant une période de chasse de 4 semaines à 4 mois, la fluorescence GFP diminuera dans les cellules cycliques et seuls les LRC conserveront la fluorescence⁶. L’avantage de cette méthode est que les CRL marqués peuvent être isolés et restent viables pour la culture cellulaire ou les analyses fonctionnelles en aval ^6,7. Certaines études ont rapporté un étiquetage inexact des cellules souches quiescentes lorsqu’elles sont poursuivies pour une utilisation à long terme. Ce résultat était dû à une expression de fond fuyante de la souche H2B-GFP et non à la réponse appropriée régulée par la tétracycline¹⁵.

De plus, la plupart de la littérature dans le passé utilisait la détection des LRC principalement sur des diapositives sectionnées, qui sont bidimensionnelles et souvent biaisées à tort pour montrer l’emplacement précis et le nombre de LRC. L’approche présentait des angles incorrects pour les sections de structures tissulaires complexes¹⁶. L’autre méthode consistait à obtenir des images 3D à partir de sections en série et à effectuer des reconstructions post-image. Ces étapes étaient imprécises en raison de la distorsion de l’image due aux variations dans chaque section de série dues aux sections compressées ou étirées, ce qui entraînait des informations manquantes^16,17,18. La méthode était également laborieuse et prenait beaucoup de temps.

Pour faciliter l’imagerie à montage complet des LRC, les échantillons doivent être clairs tout en maintenant la fluorescence. Les techniques actuelles de nettoyage tissulaire peuvent être classées en trois grandes catégories : les techniques de nettoyage tissulaire à base de solvants organiques, les techniques de nettoyage tissulaire à base de réactifs aqueux et les techniques de nettoyage tissulaire à base d’hydrogel^17,19. Le système de solvant associé au polyéthylène glycol (PEG) (PEGASOS) a été récemment développé. Cette approche rend presque tous les types de tissus transparents et préserve la fluorescence endogène, y compris les tissus durs tels que les os et les dents²⁰. La méthode PEGASOS présente des avantages par rapport aux autres méthodes de nettoyage des tissus, en particulier dans le nettoyage des dents et des os. La plupart des autres méthodes ne pouvaient dégager que partiellement les tissus durs, avoir de longs temps de traitement ou nécessiter des réactifs coûteux²¹. En outre, la méthode PEGASOS peut préserver efficacement la fluorescence endogène par rapport aux autres méthodes.

Cette littérature nous a amenés à créer une nouvelle méthode d’étude cellulaire. Nous avons combiné les avantages de détection LRC du marquage EdU avec l’imagerie 3D à montage entier la plus supérieure des échantillons nettoyés par les tissus; Les échantillons ont été traités avec la technique avancée de nettoyage des tissus associée au système de solvant associé au polyéthylène glycol (PEG) (PEGASOS)¹⁵. La transparence des tissus durs nous a permis de reconstruire le signal 3D de la fluorescence des LRC in vivo sans casser les dents ou la mandibule, créant ainsi un moyen plus précis de visualiser et de quantifier les LRC.

Dans cette étude, nous fournissons un guide innovant pour visualiser les LRC dans l’incisive de souris. Nous avons fait une approche visuelle 3D pour déterminer l’emplacement et la quantité de LRC dans la niche des cellules souches incisives de souris. Ce projet a utilisé le marquage EdU, les techniques de nettoyage tissulaire PEGASOS et la microscopie confocale. Notre méthode de marquage EdU des LRC sur des tissus entiers et l’utilisation d’un échantillon dégagé et transparent surmontent à la fois les limites des lames sectionnées traditionnelles et d’autres méthodes de marquage ADN désavantageuses. Ainsi, notre technique sera adaptée aux études sur l’homéostasie des cellules souches nécessitant la détection des LRC, notamment sur les tissus durs. Le protocole peut être tout aussi avantageux pour ceux qui se concentrent sur l’homéostasie des cellules souches dans d’autres tissus et organes.