Sürekli büyüyen fare kesici ucu, yetişkin kök hücreleri incelemek için mükemmel bir modeldir¹. Kesici dişin proksimal tarafında bulunan epitel (labial ve lingual servikal loop) ve mezenkimal kök hücreler (labial ve lingual servikal loop arasında) ameloblastlara, odontoblastlara ve diş pulpası hücrelerine farklılaşır. Bu eşsiz süreç, doku kaybının ve cironun telafisi için bir hücre kaynağı sağlar². Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1 gibi birkaç kök hücre belirteci olmasına rağmen. fare kesici dişlerinde yetişkin kök hücrelerin alt kümeleri için in vivo olarak tanımlanmıştır, tek başına kullanıldığında kök hücre popülasyonlarını temsil etmede yetersizdir 1,3,4,5. Uzun ömürlü sessiz hücrelerin nükleotid analog DNA etiketleme ve retansiyonu ile görselleştirilmesi, yetişkin kök hücrelerin çoğu alt kümesi için tarafsız tespit sağlayabilir⁶. Ayrıca, bu yaklaşım birçok kök hücre tanımlama yöntemi^{arasında yararlıdır 7} hücre davranışını ve diş kök hücre popülasyonlarının homeostazını anlamak için ^3,8. Bölünen kök hücreler kayda değer bir kovalamacadan sonra DNA etiketlerini kaybederken, varsayılan sessiz kök hücreler DNA etiketlerini korur ve onları etiket tutucu hücreler (LRC’ler^{) olarak} kabul eder6. Bölünmeyen kök hücreler tarafından DNA etiketlemesi ve tutulması, varsayılan yetişkin kök hücreleri nişlerinde işaretleyecek ve bulacaktır.

Son yıllarda, timidin analog 5-bromo-2′-deoksiüridin (BrdU) etiketlemesi, hücre proliferasyon testleri ^6,9 için hantal, zaman alıcı ve yüksek çözünürlüklü mikroskopi uyumsuz 3H-timidin DNA etiketleme yönteminin yerini almıştır. Son yıllarda, 5-etinil-2′-deoksiüridin (EdU) etiketleme tekniği BrdU üzerinde giderek daha fazla kullanılmaktadır. Bu model birkaç nedenden dolayı ortaya çıkmıştır. İlk olarak, BrdU yöntemi yavaş ve emek yoğundur. Kullanıcı koşulları değişkendir ve örneklerdeki ultrayapıyı koruyamaz (DNA denatürasyonu nedeniyle). Benzer şekilde, BrdU yöntemi hücrelerin antijenitesini kaybeder, böylece ko-lokalizasyon deneyleri ve in vivo kök hücre^nakli 3,7,9,10,11,12 gibi aşağı akış fonksiyonel analizleri ve tahlilleri için verimsiz hale getirir. BrdU ayrıca embriyonik gelişim^6’da LRC’leri etiketlemek için uygun olmayan bir teratojendir. Ayrıca, BrdU yöntemi tüm montajlı numunelerde kullanıldığında verimsizdir. Dezavantajları, numunelerin derin kısmında antikorların düşük penetrasyonu veya derin penetrasyon için uzun bir antikor inkübasyon süresinin gerekliliğidir¹³. EdU etiketleme, numunelerin denatüre edilmesi adımlarından kaçar, böylece ultra yapıyı korur. Bu özellik, ko-lokalizasyon deneyleri ve kök hücre nakli gibi aşağı akış fonksiyonel analizleri için avantajlıdır^11,12. Ayrıca, EdU etiketleme son derece hassas ve hızlıdır; EdU etiketlerini Cu(I)-katalizli [3 + 2] sikloekleme reaksiyonu (“tıklama” kimyası)¹⁴ yoluyla tespit etmek için hızla emilen ve daha küçük boyutlu floresan azidlerin kullanılması nedeniyle numune penetrasyonu yüksektir.

Giderek daha fazla uygulanan bir diğer DNA etiketleme yöntemi, mühendislik ürünü transgenik farelerin kullanılmasıdır. Bu fareler, tetrasikline duyarlı bir düzenleyici element ^5,14 tarafından kontrol edilen histon 2B yeşil floresan proteinini (H2B-GFP) eksprese eder. Fareleri 4 haftalık ila 4 aylık bir kovalama süresi boyunca tetrasiklin chow / su ile besledikten sonra, GFP floresansı döngü hücrelerinde azalacak ve sadece LRC’ler floresan^6’yı koruyacaktır. Bu yöntemin avantajı, etiketli LRC’lerin izole edilebilmesi ve hücre kültürü veya aşağı akış fonksiyonel analizleri için uygun kalmasıdır ^6,7. Bazı çalışmalar, uzun süreli kullanım için kovalandığında sessiz kök hücrelerin yanlış etiketlendiğini bildirmiştir. Bu sonuç, H2B-GFP suşundan sızan bir arka plan ifadesinden kaynaklanıyordu ve uygun tetrasiklin tarafından düzenlenmiş yanıttan^{kaynaklanmıyordu15}.

Dahası, geçmişte çoğu literatür LRC’lerin tespitini esas olarak iki boyutlu olan ve LRC’lerin doğru yerini ve sayısını göstermede genellikle hatalı bir şekilde önyargılı olan kesitli slaytlarda kullanmıştır. Yaklaşım, karmaşık doku yapılarının kesitleri için yanlış açılar gösterdi¹⁶. Diğer yöntem ise seri kesitlerden 3D görüntüler elde etmek ve görüntü sonrası rekonstrüksiyonlar yapmaktı. Bu adımlar, sıkıştırılmış veya gerilmiş bölümler nedeniyle her seri bölümdeki varyasyonlardan kaynaklanan görüntü bozulması nedeniyle yanlıştı ve eksik bilgilere neden oldu^16,17,18. Yöntem aynı zamanda zahmetli ve zaman alıcıydı.

LRC’lerin tam montajlı görüntülemesini kolaylaştırmak için, floresan iyi korunurken numunelerin netleştirilmesi gerekir. Güncel doku temizleme teknikleri üç ana kategoriye ayrılabilir: organik solvent bazlı doku temizleme teknikleri, sulu reaktif bazlı doku temizleme teknikleri ve hidrojel bazlı doku temizleme teknikleri^17,19. Polietilen glikol (PEG) ile ilişkili çözücü sistemi (PEGASOS) yakın zamanda geliştirilmiştir. Bu yaklaşım neredeyse tüm doku tiplerini şeffaf hale getirir ve kemik ve dişler gibi sert dokular da dahil olmak üzere endojen floresanı korur²⁰. PEGASOS yönteminin özellikle diş ve kemik materyallerinin temizlenmesinde diğer doku temizleme yöntemlerine göre avantajları vardır. Diğer yöntemlerin çoğu sert dokuları yalnızca kısmen temizleyebilir, uzun işlem sürelerine sahip olabilir veya maliyetli reaktifler gerektirebilir²¹. Ayrıca, PEGASOS yöntemi endojen floresanı diğer yöntemlere göre etkili bir şekilde koruyabilir.

Bu literatür bizi hücre çalışması için yeni bir yöntem oluşturmaya yönlendirdi. EdU etiketlemenin LRC’lerin algılama avantajlarını, dokudan arındırılmış numunelerin en üstün 3D tam montajlı görüntülemesiyle birleştirdik; Numuneler gelişmiş polietilen glikol (PEG) ile ilişkili solvent sistemi (PEGASOS) doku temizleme tekniği¹⁵ ile işlenmiştir. Sert doku saydamlığı, LRC’lerin floresansının 3D sinyalini dişleri veya mandibulayı kırmadan in vivo olarak yeniden yapılandırmamızı sağladı ve LRC’leri görselleştirmek ve ölçmek için daha doğru bir yol yarattı.

Bu çalışmada, fare kesici dişindeki LRC’leri görselleştirmek için yenilikçi bir kılavuz sunuyoruz. LRC’lerin fare kesici kök hücre nişi içindeki yerini ve miktarını belirlemek için 3D görsel bir yaklaşım yaptık. Bu projede EdU etiketleme, PEGASOS doku temizleme teknikleri ve konfokal mikroskopi kullanılmıştır. LRC’leri tüm montajlı doku üzerinde etiketleme ve temizlenmiş ve şeffaf bir numunenin kullanılması yöntemimiz, hem geleneksel kesitli slaytların hem de diğer dezavantajlı DNA etiketleme yöntemlerinin sınırlamalarının üstesinden gelir. Bu nedenle tekniğimiz, özellikle sert dokularda LRC tespiti gerektiren kök hücre homeostazı çalışmaları için uygun olacaktır. Protokol, diğer doku ve organlardaki kök hücre homeostazına odaklananlar için eşit derecede avantajlı olabilir.