Den kontinuerlig voksende musesnittet er en utmerket modell for å studere voksne stamceller¹. Epitelet (labial og lingual cervical loop) og mesenkymale stamceller (mellom labial og lingual cervical loop) som ligger på den proksimale siden av snittet, skiller seg ut i ameloblaster, odontoblaster og tannpulpceller. Denne unike prosessen gir en kilde til celler for kompensasjon av vevstap og omsetning². Selv om flere stamcellemarkører som Sox2, Gli1, Thy1 / CD90, Bmi1, etc. har blitt identifisert in vivo for undergrupper av voksne stamceller i musefortenner, er de utilstrekkelige til å representere stamcellepopulasjonene når de brukes alene 1,3,4,5. Visualisering av langlivede hvilende celler ved nukleotidanalog DNA-merking og retensjon kan gi objektiv deteksjon for de fleste undergrupper av voksne stamceller⁶. Videre er denne tilnærmingen nyttig blant mange stamcelleidentifikasjonsmetoder⁷ for å forstå celleadferd og homeostase av dental stamcellepopulasjoner ^3,8. Mens de delende stamcellene ville miste DNA-merkingen etter en betydelig jakt, beholder de antatte hvilende stamcellene sin DNA-etikett, og anser dem som etikettbeholdende celler (LRC)⁶. DNA-merking og oppbevaring av ikke-delende stamceller vil markere og lokalisere de antatte voksne stamceller i sine nisjer.

I løpet av de siste årene har tymidinanalog 5-brom-2′-deoksyuridin (BrdU) merking erstattet den tungvinte, tidkrevende og høyoppløselige mikroskopien inkompatibel 3H-tymidin DNA-merkingsmetode for celleproliferasjonsanalyser ^6,9. I de senere år har 5-etynyl-2′-deoksyuridin (EdU) merkingsteknikken blitt stadig mer brukt over BrdU. Dette mønsteret oppsto av flere grunner. For det første er BrdU-metoden langsom og arbeidskrevende. Brukerforholdene er varierende, og det er ikke i stand til å bevare ultrastrukturen i prøver (på grunn av DNA-denaturering). På samme måte mister BrdU-metoden cellens antigenisitet, noe som gjør den ineffektiv for nedstrøms funksjonelle analyser og analyser som samlokaliseringseksperimenter og in vivo stamcelletransplantasjon 3,7,9,10,11,12. BrdU er også et teratogen, som ikke er egnet for merking av LRC i embryonal utvikling⁶. BrdU-metoden er også ineffektiv når den brukes i helmonterte prøver. Ulempene er lav penetrasjon av antistoffer i den dype delen av prøvene eller kravet om en lang antistoffinkubasjonsperiode for dyp penetrasjon¹³. EdU-merking unnslipper trinnene til denaturerende prøver, og bevarer dermed ultrastrukturen. Denne funksjonen er fordelaktig for nedstrøms funksjonelle analyser som samlokaliseringseksperimenter og stamcelletransplantasjon^11,12. EdU-merking er også svært følsom og rask; prøvepenetrasjonen er høy på grunn av bruk av raskt absorberte og mindre fluorescerende azider for påvisning av EdU-etiketter gjennom en Cu(I)-katalysert [3 + 2] cykloaddisjonsreaksjon (“klikk” kjemi)¹⁴.

En annen stadig mer anvendt DNA-merkingsmetode er bruken av konstruerte transgene mus. Disse musene uttrykker histon 2B grønt fluorescerende protein (H2B-GFP) kontrollert av et tetracyklin-responsivt regulatorelement ^5,14. Etter å ha matet mus med tetracyklin chow / vann i en 4-ukers til 4-måneders jaktperiode, vil GFP-fluorescensen avta i sykkelceller, og bare LRC beholder fluorescensen⁶. Fordelen med denne metoden er at de merkede LRC-ene kan isoleres og forbli levedyktige for cellekultur eller nedstrøms funksjonelle analyser ^6,7. Noen studier rapporterte unøyaktig merking av hvilende stamceller når de ble jaget for langvarig bruk. Dette resultatet skyldtes et lekkende bakgrunnsuttrykk fra H2B-GFP-stammen og ikke den passende tetracyklinregulerte responsen¹⁵.

Videre brukte de fleste litteratur tidligere LRC-deteksjonen hovedsakelig på seksjonerte lysbilder, som er todimensjonale og ofte feilaktig partisk når det gjelder å vise nøyaktig plassering og antall LRC-er. Tilnærmingen viste feil vinkler for seksjoner av komplekse vevsstrukturer¹⁶. Den andre metoden var å skaffe 3D-bilder fra serielle seksjoner og utføre rekonstruksjoner etter bildet. Disse trinnene var unøyaktige på grunn av bildeforvrengning fra variasjoner i hver serieseksjon på grunn av komprimerte eller strakte seksjoner, noe som resulterte i manglende informasjon^16,17,18. Metoden var også arbeidskrevende og tidkrevende.

For å legge til rette for helmontert avbildning av LRC, må prøvene gjøres klare mens fluorescensen er godt vedlikeholdt. Nåværende vevsfjerningsteknikker kan klassifiseres i tre hovedkategorier: organiske løsningsmiddelbaserte vevsfjerningsteknikker, vandige reagensbaserte vevsrensingsteknikker og hydrogelbaserte vevsfjerningsteknikker^17,19. Det polyetylenglykol (PEG)-assosierte løsningsmiddelsystemet (PEGASOS) er nylig utviklet. Denne tilnærmingen gjør nesten alle typer vev gjennomsiktige og bevarer endogen fluorescens, inkludert hardt vev som bein og tenner²⁰. PEGASOS-metoden har fordeler i forhold til andre vevsfjerningsmetoder, spesielt når det gjelder å rydde tann- og beinmaterialer. De fleste andre metoder kunne bare delvis fjerne hardt vev, ha lang behandlingstid eller kreve kostbare reagenser²¹. PEGASOS-metoden kan også effektivt bevare endogen fluorescens over andre metoder.

Denne litteraturen førte oss til å skape en ny metode for cellestudier. Vi kombinerte LRC-deteksjonsfordelene ved EdU-merking med den mest overlegne 3D-helmonterte avbildningen av vevsklarerte prøver; prøvene ble behandlet med avansert polyetylenglykol (PEG)-assosiert løsningsmiddelsystem (PEGASOS) vevsclearing teknikk¹⁵. Gjennomsiktighet i hardt vev gjorde det mulig for oss å rekonstruere 3D-signalet til LRCs fluorescens in vivo uten å bryte tennene eller kjeven, noe som skaper en mer nøyaktig måte å visualisere og kvantifisere LRC på.

I denne studien gir vi en innovativ guide for å visualisere LRC i musesnittet. Vi laget en 3D-visuell tilnærming for å bestemme plasseringen og mengden av LRC-er i musens fortennende stamcellenisje. Dette prosjektet brukte EdU-merking, PEGASOS vevsryddingsteknikker og konfokalmikroskopi. Vår metode for EdU-merking av LRC-ene på helmontert vev og bruk av en ryddet og gjennomsiktig prøve overvinner både begrensningene i tradisjonelle seksjonerte lysbilder og andre ufordelaktige DNA-merkingsmetoder. Dermed vil vår teknikk være egnet for studier på stamcellehomeostase som krever LRC-deteksjon, spesielt på hardt vev. Protokollen kan være like fordelaktig for de som fokuserer på stamcellehomeostase i andre vev og organer.