Detection and Quantitation of Label-Retaining Cells in Mouse Incisors using a 3D Reconstruction Approach after Tissue Clearing
Summary
마우스 앞니는 줄기 세포 틈새에 귀중한 표지 유지 세포를 포함합니다. 우리는 라벨 유지 세포를 편견 없이 검출하고 정량화하는 새로운 방법을 가지고 있습니다. 우리의 연구는 하악의 PEGASOS 조직 제거 후 EdU 라벨링과 3D 재구성 접근법을 사용했습니다.
Abstract
쥐 앞니는 마우스의 수명 동안 지속적으로 성장하는 기관입니다. 앞니의 근위 조직에 존재하는 상피 및 중간엽 줄기 세포는 아멜로아세포, 치모세포 및 치수 섬유아세포로 분화할 자손을 생성합니다. 이 세포는 앞니 조직의 지속적인 회전율을 지원하는 데 중요하므로 쥐 앞니는 성체 줄기 세포의 항상성을 연구하기 위한 훌륭한 모델입니다. 줄기 세포는 5-ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU)과 같은 뉴클레오티드 유사체에 의해 표지 될 수있는 수명이 긴 정지 세포를 함유하고있는 것으로 여겨진다. 셀은 시간이 지남에 따라 이 레이블을 유지하며 그에 따라 레이블 유지 셀(LRC)로 명명됩니다. 생체 내에서 LRC를 시각화하기 위한 접근 방식은 줄기 세포 항상성을 모니터링하기 위한 강력한 도구를 제공합니다. 본 연구에서는 LRC를 시각화하고 분석하는 방법에 대해 설명하였다. 당사의 혁신적인 접근 방식은 조직 세척 후 마우스 앞니의 LRC와 전체 장착 EdU 염색 후 컨포칼 현미경 및 이미징 소프트웨어를 사용한 3차원(3D) 재구성을 특징으로 합니다. 이 방법은 단면 슬라이드에 대한 기존 LRC 분석과 비교하여 3D 이미징 획득 및 비편향 정량화를 가능하게 합니다.
Introduction
지속적으로 성장하는 쥐 앞니는 성체 줄기 세포 연구를 위한 훌륭한 모델이다1. 앞니의 근위부에 상피(순순 및 설측 자궁경부 루프)와 중간엽 줄기세포(순순과 설측 경추 루프 사이)는 아멜로모세포, 치모세포, 치수 세포로 분화합니다. 이 독특한 과정은 조직 손실과 회전율을 보상하기 위한 세포의 공급원을 제공한다2. Sox2, Gli1, Thy1/CD90, Bmi1 등과 같은 여러 줄기 세포 마커가 있지만. 마우스 앞니에서 성체 줄기 세포의 서브세트에 대해 생체 내에서 확인되었으며, 이들은 단독으로 사용될 때 줄기 세포 집단을 나타내는데 부적절하다 1,3,4,5. 뉴클레오티드 유사체 DNA 라벨링 및 보존에 의해 수명이 긴 정지 세포를 시각화하면 대부분의 성체 줄기 세포 하위 집합에 대해 편견 없는 검출을 제공할 수있습니다 6. 또한, 이러한 접근법은 세포 거동과 치아 줄기 세포 집단3,8의 항상성을 이해하기 위한 많은 줄기 세포 식별 방법7 중에서 유용하다. 분열하는 줄기 세포는 상당한 추적 후에 DNA 라벨링을 잃게 되지만, 추정되는 정지 줄기 세포는 DNA 라벨을 유지하여 라벨 유지 세포(LRC)로 간주합니다6. 분열하지 않는 줄기 세포에 의한 DNA 라벨링 및 보유는 틈새 시장에서 추정되는 성체 줄기 세포를 표시하고 찾습니다.
지난 몇 년 동안 티미딘 유사체 5-브로모-2′-데옥시유리딘(BrdU) 표지는 세포 증식 분석을 위한 번거롭고 시간이 많이 소요되는 고해상도 현미경 비호환 3H-티미딘 DNA 표지 방법을 대체했습니다 6,9. 최근 몇 년 동안 5-ethynyl-2′-deoxyuridine(EdU) 표지 기술이 BrdU보다 점점 더 많이 사용되고 있습니다. 이 패턴은 몇 가지 이유로 나타났습니다. 첫째, BrdU 방법은 느리고 노동 집약적입니다. 사용자 조건은 가변적이며 검체의 미세 구조를 보존할 수 없습니다(DNA 변성으로 인해). 마찬가지로, BrdU 방법은 세포의 항원성을 상실하여 공동 국소화 실험 및 생체 내 줄기 세포 이식 3,7,9,10,11,12와 같은 다운스트림 기능 분석 및 분석에 비효율적입니다. BrdU는 또한 기형 유발 물질로, 배아 발달에서 LRC를 표지하는 데 적합하지 않다6. 또한 BrdU 방법은 전체 장착 시편에 사용할 때 비효율적입니다. 단점은 검체의 깊은 부분에서의 항체 침투율이 낮거나 깊은 침투를 위해 긴 항체 배양 기간이 필요하다는 점이다13. EdU 라벨링은 표본을 변성시키는 단계를 벗어나 미세 구조를 보존합니다. 이 특징은 co-localization 실험 및 줄기 세포 이식과 같은 다운스트림 기능 분석에 유리합니다11,12. 또한 EdU 라벨링은 매우 민감하고 빠릅니다. Cu(I) 촉매 [3 + 2] 고리첨가 반응(“클릭” 화학)14을 통해 EdU 라벨을 검출하기 위해 빠르게 흡수되고 더 작은 크기의 형광 아지드를 사용하기 때문에 시편 침투율이 높습니다.
점점 더 많이 적용되는 또 다른 DNA 라벨링 방법은 조작된 형질전환 마우스를 사용하는 것입니다. 이 마우스는 테트라사이클린 반응성 조절 요소 5,14에 의해 제어되는 히스톤 2B 녹색 형광 단백질(H2B-GFP)을 발현합니다. 4주에서 4개월의 추적 기간 동안 생쥐에게 테트라사이클린 차우/물을 먹인 후, GFP 형광은 사이클링 세포에서 감소하고 LRC만이 형광을 유지합니다6. 이 방법의 장점은 표지된 LRC를 분리할 수 있고 세포 배양 또는 다운스트림 기능 분석에 사용할 수 있다는 것입니다 6,7. 일부 연구에서는 장기간 사용을 위해 추적했을 때 정지 줄기 세포의 부정확한 라벨링을 보고했습니다. 이 결과는 H2B-GFP 균주에서 새는 배경 발현으로 인한 것이지 적절한 테트라사이클린 조절 반응이 아니었기 때문이다15.
더욱이 과거의 대부분의 문헌은 주로 단면 슬라이드에서 LRC 검출을 사용했는데, 이는 2차원이며 LRC의 정확한 위치와 수를 표시하는 데 종종 잘못 편향되어 있습니다. 이 접근법은 복잡한 조직 구조의 절편에 대해 부정확한 각도를 표시하였다16. 다른 방법은 직렬 섹션에서 3D 이미지를 얻고 사후 이미지 재구성을 수행하는 것이었습니다. 이들 단계들은 압축되거나 늘어난 섹션들로 인한 각각의 시리얼 섹션들의 변형으로 인한 이미지 왜곡 때문에 부정확하였고, 그 결과 정보(16,17,18)가 누락되었다. 이 방법은 또한 힘들고 시간이 많이 걸렸습니다.
LRC의 전체 마운트 이미징을 용이하게 하려면 형광이 잘 유지되는 동안 샘플을 선명하게 해야 합니다. 현재의 조직 투명화 기술은 세 가지 주요 범주로 분류할 수 있다: 유기 용매 기반 조직 투명화 기술, 수성 시약 기반 조직 투명화 기술, 및 하이드로겔 기반 조직 투명화 기술17,19. 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관련 용매 시스템(PEGASOS)이 최근에 개발되었습니다. 이 접근법은 거의 모든 유형의 조직을 투명하게 만들고 뼈와 치아와 같은 경조직을 포함한 내인성 형광을 보존한다20. PEGASOS 방법은 특히 치아 및 뼈 재료를 청소할 때 다른 조직 청소 방법에 비해 장점이 있습니다. 대부분의 다른 방법들은 경조직을 부분적으로만 제거할 수 있거나, 처리 시간이 길거나, 값비싼 시약을 필요로 한다21. 또한 PEGASOS 분석법은 다른 분석법에 비해 내인성 형광을 효율적으로 보존할 수 있습니다.
이 문헌은 우리로 하여금 세포 연구를 위한 새로운 방법을 만들도록 이끌었습니다. 우리는 EdU 라벨링의 LRC 검출 이점과 조직 투명 표본의 가장 우수한 3D 전체 마운트 이미징을 결합했습니다. 샘플을 고급 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 관련 용매 시스템(PEGASOS) 조직 투명화 기술15로 처리하였다. 경조직 투명성을 통해 치아나 하악골을 부러뜨리지 않고 생체 내에서 LRC 형광의 3D 신호를 재구성할 수 있어 LRC를 시각화하고 정량화하는 보다 정확한 방법을 만들 수 있었습니다.
이 연구에서는 마우스 앞니에서 LRC를 시각화하는 혁신적인 가이드를 제공합니다. 우리는 마우스 앞니 줄기 세포 틈새 내에서 LRC의 위치와 양을 결정하기 위해 3D 시각적 접근 방식을 만들었습니다. 이 프로젝트에서는 EdU 라벨링, PEGASOS 조직 투명화 기술 및 컨포칼 현미경을 사용했습니다. 전체 마운트 조직에 LRC를 EdU로 라벨링하는 당사의 방법과 투명하고 투명한 표본을 사용하는 방법은 기존의 절편 슬라이드와 기타 불리한 DNA 라벨링 방법의 한계를 모두 극복합니다. 따라서 우리의 기술은 LRC 검출이 필요한 줄기 세포 항상성 연구, 특히 경조직에 적합 할 것입니다. 이 프로토콜은 다른 조직과 기관의 줄기 세포 항상성에 초점을 맞춘 사람들에게도 똑같이 유리할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
증식하는 세포를 가능한 한 많이 표지하기 위해 성장하는 신생아 마우스에 다회 투여(BrdU, EdU)를 다회 투여한다 1,6,13. 추격 기간은 조직의 재생율 6,13에 관한 중요한 단계로 간주된다. 마우스 앞니는 매달 스스로 갱신됩니다. 이 특성을 통해 연구자는 추적 기간을 4주 이상으로 설정?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
원고를 편집해 주신 Meghann K. Holt에게 감사드립니다. 이 연구는 NIH/NIDCR 보조금 DE026461 및 DE028345와 텍사스 A&M 치과대학에서 Xiaofang Wang 박사에게 지원하는 스타트업 자금의 지원을 받았습니다.
Materials
| 0.5 M EDTA | Sigma Aldrcih | E9884 | |
| 20 × Objective/NA 0.9 | Leica | 507702 | |
| 50 mL Falcon Centrifuge Tubes | Falcon | 352070 | |
| BD PrecisionGlide Needle | BD | REF 305111 | |
| Bezyl benzoate (BB) | Sigma Aldrcih | 409529 | |
| Bitplane 9.0.1 | Imaris | ||
| BRAND cavity slides | Millipore Sigma | BR475505 | |
| C57BL/6J mice | Jackson Laboratory | Strain #:000664 | |
| Circulation Pump | VWR | 23609-170 | |
| CuSO4 | Sigma Aldrcih | 451657 | |
| DMSO | Sigma Aldrcih | D8418 | |
| EdU | Carboynth | NE08701 | |
| Heparin | Miiilipore Sigma | H3149 | |
| Imaging System | Olympus | DP27 | |
| LAS X Software | Leica | ||
| Olympus Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Paraformaldehye | Sigma Aldrich | P6148 | |
| PBS | Sigma Aldrich | P4417 | |
| PEGMMA500 | Sigma Aldrich | 447943 | |
| Quadrol | Sigma Aldrich | 122262 | |
| Sodium Ascorbate | Sigma Aldrich | 11140 | |
| Sulfa-Cyanine 3 Azide | Lumiprobe | D1330 | |
| TBS-10X | Cell Signaling Technology | 12498 | |
| TCS SP8 Confocal Microscope | Leica | ||
| tert-butanol (tB) | Sigma Aldrich | 360538 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 |
Referências
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