持续生长的小鼠门牙是研究成体干细胞的极好模型¹。位于门牙近端的上皮（唇颈袢）和间充质干细胞（唇颈袢和颈舌之间）分化为釉母细胞、成牙细胞和牙髓细胞。这种独特的过程为补偿组织损失和周转提供了细胞来源²。虽然有几种干细胞标志物，如Sox2，Gli1，Thy1 / CD90，Bmi1等。已经在体内鉴定出小鼠门牙中成体干细胞亚群，当单独使用时，它们不足以代表干细胞群¹，³，^4，5。通过核苷酸类似物DNA标记和保留可视化长寿命静止细胞可以为大多数成体干细胞亚群提供无偏倚检测⁶。此外，该方法在许多干细胞鉴定方法⁷中是有用的，用于了解细胞行为和牙科^{干细胞群的}稳态3^，8。虽然分裂的干细胞在经过相当大的追逐后会失去其DNA标记，但假定的静止干细胞保留其DNA标记，认为它们是标记保留细胞（LRC）⁶。非分裂干细胞的DNA标记和保留将标记并定位假定的成体干细胞在其生态位中。

在过去的几年中，胸苷类似物5-溴-2′-脱氧尿苷（BrdU）标记取代了用于细胞增殖测定的繁琐，耗时且高分辨率的显微镜不兼容的3H-胸苷DNA标记方法^6，9。近年来，5-乙炔基-2′-脱氧尿苷（EdU）标记技术越来越多地用于BrdU。这种模式的出现有几个原因。首先，BrdU方法速度慢且劳动密集。用户条件是可变的，并且无法保留标本中的超微结构（由于DNA变性）。同样，BrdU方法失去了细胞的抗原性，因此对于下游功能分析和测定（例如共定位实验和体内干细胞移植）效率低下3，7，⁹，10，^11，12。BrdU也是一种致畸剂，不适合在胚胎发育中标记^LRCs6。此外，BrdU方法在用于整个安装试样时效率低下。缺点是抗体在标本深部的渗透率低，或者需要较长的抗体孵育期才能深入¹³。EdU标记省去了变性标本的步骤，从而保留了超微结构。此功能有利于下游功能分析，例如共定位实验和干细胞移植^11，12。此外，EdU 标签具有高度的灵敏度和快速性;由于使用快速吸收和较小尺寸的荧光叠氮化物通过Cu（I）催化的[3 + 2]环加成反应（“点击”化学）检测EdU标记，因此样品穿透力很高¹⁴。

另一种应用日益广泛的DNA标记方法是使用工程转基因小鼠。这些小鼠表达由四环素响应调节元件^5，14控制的组蛋白2B绿色荧光蛋白（H2B-GFP）。用四环素食物/水喂养小鼠4周至4个月的追逐期后，GFP荧光将在循环细胞中减弱，只有LRC保留荧光⁶。该方法的优点是标记的LRC可以分离，并且对于细胞培养或下游^{功能分析仍然}有效6^，7。一些研究报告了长期使用时静态干细胞的标记不准确。该结果是由于H2B-GFP菌株的背景表达泄漏，而不是适当的四环素调节反应¹⁵。

此外，过去大多数文献主要在切片玻片上使用LRCs检测，切片玻片是二维的，在显示LRC的准确位置和数量时经常错误地偏向。该方法显示复杂组织结构切片的角度不正确¹⁶.另一种方法是从连续切片获取3D图像并进行图像后重建。这些步骤是不准确的，因为压缩或拉伸部分导致每个序列部分的变化导致图像失真，导致信息缺失^16，17，18。这种方法也很费力和耗时。

为了便于LRC的全卡口成像，需要使样品清晰，同时保持良好的荧光。目前的组织清除技术可分为三大类：基于有机溶剂的组织清除技术、基于水试剂的组织清除技术和基于水凝胶的组织清除技术^17，19。聚乙二醇（PEG）相关溶剂体系（PEGASOS）最近被开发出来。这种方法使几乎所有类型的组织透明并保留内源性荧光，包括硬组织，如骨骼和牙齿²⁰。PEGASOS方法比其他组织清除方法具有优势，特别是在清除牙齿和骨骼材料方面。大多数其他方法只能部分清除硬组织，处理时间长，或者需要昂贵的试剂²¹。此外，与其他方法相比，PEGASOS方法可以有效地保留内源性荧光。

这些文献促使我们创造了一种新的细胞研究方法。我们将EdU标记的LRCs检测优势与组织清除标本最卓越的3D全安装成像相结合;样品采用先进的聚乙二醇（PEG）相关溶剂系统（PEGASOS）组织清除技术处理¹⁵。硬组织透明度使我们能够在不折断牙齿或下颌 骨的情况下重建 体内LRCs荧光的3D信号，从而创建一种更准确的方法来可视化和量化LRC。

在这项研究中，我们提供了一个创新的指南来可视化小鼠门牙中的LRC。我们制作了一种3D视觉方法来确定LRC在小鼠门牙干细胞生态位中的位置和数量。该项目使用了EdU标记，PEGASOS组织清除技术和共聚焦显微镜。我们的EdU在整个安装组织上标记LRC的方法以及使用透明和透明的标本的方法克服了传统切片载玻片和其他不利的DNA标记方法的局限性。因此，我们的技术将适用于需要LRCs检测的干细胞稳态研究，特别是在硬组织上。该协议对那些专注于其他组织和器官中的干细胞稳态的人同样有利。