이 연구에서, 우리는 표준 피더가없는 hPSC 배양물을 사용하여 간단하면서도 견고한 피질 오가노이드 배양 시스템에 대한 상세한 기술을 제공합니다. 이것은 시험관 내에서 뇌 노화의 측면을 모델링하는 오가노이드를 생성하기위한 신속하고 효율적이며 재현 가능한 프로토콜입니다.
뇌 오가노이드는 개발 중인 인간 뇌의 입체 모델이며 질병 모델링 및 대규모 게놈 및 약물 스크리닝을 위한 강력하고 최첨단 플랫폼을 제공합니다. 뇌 오가노이드에서 세포의 자기 조직 특성과 그 생성을위한 사용 가능한 프로토콜의 범위가 증가함에 따라 오가노이드 간의 이질성 및 가변성에 대한 문제가 확인되었습니다. 이 프로토콜 논문에서 우리는 이러한 문제를 크게 극복하고 1 개월 이내에 신경 외배엽 선조로부터 피질 오가노이드를 생성하고 1 년 이상 유지할 수있는 강력하고 복제 가능한 프로토콜을 설명합니다. 이 재현성이 높은 프로토콜은 표준 조직 배양실에서 쉽게 수행 할 수 있으며 개발 중인 인간 피질에서 일반적으로 발견되는 풍부한 다양성의 세포 유형을 가진 오가노이드를 초래합니다. 초기 발달 구성에도 불구하고 뉴런 및 기타 인간 뇌 세포 유형은 장기간 체외 배양 후 신경 세포에서 노화의 전형적인 징후를 나타내기 시작하여 노화 관련 신경 과정을 연구하는 데 유용하고 유용한 플랫폼이됩니다. 이 프로토콜은 또한 노화 관련 베타-갈락토시다제 염색을 사용하여 피질 뇌 오가노이드에서 이러한 노화 세포를 검출하는 방법을 개략적으로 설명한다.
인간의 뇌에 대한 우리의 현재 지식은 주로 동물 모델과 사후 뇌 표본에 기반을두고 있습니다. 줄기 세포 생물학은 인간 뇌 발달의 기본 생물학과 인간 뇌 장애의 병리학 적 동인에 대한 새로운 통찰력을 제공하는 빠르게 발전하는 분야입니다. 인간 다능성 줄기 세포 (hPSCs)는 일반적으로 발달하는 인간 뇌의 발달 궤적, 세포 구성 및 구조를 되풀이하는 오가노이드, 장기 유사 3차원 (3D) 조직의 생성을 통해 인간의 뇌를 모델링하는 데 매우 유용한 도구입니다. 뇌 오가노이드는 자체 조립되어 신경 줄기 세포, 특정 신경 전구 세포, 성숙한 뉴런 및 신경교 세포 유형으로 구성됩니다. 따라서 오가노이드는 초기 인간의 뇌를 연구 할 수있는 독특한 기회를 제공하며, 이는 종종 직접 실험에 접근 할 수 없지만 혈관 구조 및 면역 체계의 부재와 같은 본질적인 한계를 가지고 있습니다.
뇌 오가노이드를 생성하는 방법론은 두 가지 다른 방법으로 추구되었습니다 : 유도되지 않은 분화와 유도 된 분화. 유도되지 않은 뇌 오가노이드 방법은 조직 형태 형성1,2를 구동하는 줄기 세포의 자발적인 고유 분화 능력에 의존하고 전뇌, 중뇌 및 뒷뇌에서 맥락막 신경총, 망막 및 중배엽에 이르기까지 다양한 세포 계보 정체성의 출현을 허용합니다. 대조적으로, 유도 뇌 오가노이드 방법은 내측 신경절 이온성 저명도3, 전뇌4, 중뇌5, 시상 하부6, 소뇌7 및 맥락막 신경총8과 같은 하나의 뇌 영역 유형을 나타내는 신경 계통의 원하는 패터닝을 향해 hPSC를 유도하기 위해 외부 요인의 실질적인 사용을 필요로합니다. 서로 다른 세포 혈통을 가진 다른 뇌 영역을 생성하는 능력과 이들을 마음대로 융합시킬 수있는 잠재력은 뇌 오가노이드를 인간의 뇌 발달을 조사하고 뇌 관련 질병의 기본 메커니즘을 해독하기위한 훌륭한 모델로 만듭니다. 뇌 오가노이드를 생성하는 이러한 방법은 인간의 뇌 영역을 모델링하는 데 획기적인 역할을 하지만, 오가노이드 간의 가변성과 이질성은 약물 스크리닝과 같은 체계적이고 정량적인 연구에 중요한 한계로 남아 있습니다.
현재의 프로토콜은 우리의 최근 논문9 에서 개발 된 방법을 기반으로하며 이중 SMAD 억제제 (SB-431542 및 LDN 193189)와의 신경 외배엽 (NEct) 동일성으로 hPSC 콜로니를 선택적으로 분화시킨 다음 FGF2 신호 전달의 영향으로 3D 신경 상피 구상체로 4 일 이내에 자체 조직 할 수있는 능력을 갖습니다. 이러한 신경상피 구상체는 분화 후 4주 이내에 생체내 유사 세포 조성을 갖는 균질한 피질 오가노이드를 확실하게 생성한다. 여기에 설명된 프로토콜은 이중 SMAD(Decapentaplegic에 대한 어머니의 억제자) 신호전달의 억제가 내피, 중배엽 및 트로피토배엽 세포 운명 선택(11)을 억제함으로써 신경외배엽 전구세포(10 )로부터 유래된 로스트랄 신경 줄기 세포로의 hPSCs의 분화를 촉진한다는 것을 보여주는 우리의 이전 발견에 기초한다(11) . 또한, hESC 인증 기저막 매트릭스에 신경 상피 구상체를 매립하면 신경 상피의 상당한 싹이 트고, 아피코바살 극성을 가진 심실을 형성합니다. 대규모 배양은 세포주, 클론 또는 배치와 무관한 피질 오가노이드의 재현성 및 균질성을 나타냈으며, 따라서 시험관 내에서 건강 및 질병에서 초기 인간 피질 발달을 모방하는 안정적이고 안정한 줄기 세포 시스템을 나타낸다. 우리는 장기간 배양 된 hPSC 유래 피질 뇌 오가노이드에서 노인성 신경 세포 마커를 검출하기위한 프로토콜을 추가로 개략적으로 설명합니다.
hPSCs를 20%-30%의 시딩 밀도로 플레이팅한 후, 세포를 3일 동안 이중 SMAD 억제제로 처리하여 hPSC 콜로니를 신경외배엽 콜로니로 분화시킨다. 그런 다음 이들 콜로니를 디스파아제로 부드럽게 들어 올리고 FGF2로 보충된 초저 부착물 6-웰 플레이트에 시딩한다. 부유 2D 콜로니는 하룻밤 사이에 3D 신경 외배엽 구상체로 자체 조직되고 FGF2로 매일 보충 된 N2 배지에서 4 일 동안 유지됩니다. 일단 구상체가 신경 상피층을 확립하면, 그들은 기저막 매트릭스에 매립 될 수 있습니다. 신선한 말단 분화 배지를 일상적으로 추가함으로써, 연구자들은 피질 오가노이드에서 신경 상피의 점진적 확장과 싹을 관찰 할 것입니다. 연구자들은 전사 및 프로테오믹 프로파일링을 수행하기 위해 이러한 오가노이드를 해리하기를 원할 수 있다. 또한 피질 오가노이드의 품질을 모니터링하기 위해 밝은 필드 이미징이 권장됩니다. 분석은 고정, 냉동 절제술 및 면역 염색에 의해 수행될 수 있다. 이러한 기술들에 대한 설명 및 방법들은 이전에 설명되었다(12). 궁극적으로,이 프로토콜은 연구자가이 논문에 설명 된대로 개발 중인 인간 피질 뇌를 모델링하고 세포 신경 노화의 측면을 연구하기 위해 균질 한 피질 뇌 오가노이드를 신속하고 견고하게 생성 할 수있게합니다.
약물 스크리닝 및 질병 모델링에서 hPSC 유래 뇌 오가노이드를 사용할 수 있도록하려면 복제 가능하고 신뢰할 수있는 프로토콜15에 따라 오가노이드를 만드는 것이 중요합니다. 뇌 오가노이드는 일반적으로 hPSCs에서 유래 된 배아체에서 생성되며, 이는 조직 확장 및 신경 분화를 촉진하는 세포 외 매트릭스에 내장됩니다. 랭커스터의 1,16,17 및 Velasco18과 같은 프로토콜과 비교할 때, 배아체에서 시작하여 개발 된 오가노이드가 뒤따르는 기본 분화 경로를 허용함으로써 우리는 배아체가 아닌 인간 NEct 세포로 피질 뇌 오가노이드 생성을 시작하면 피질 뇌 오가노이드 형성의 일관성이 향상된다는 것을 발견했습니다. 이것은 결과적으로 약물 및 표현형 스크리닝에 필요한 스케일링을 허용합니다. 인간 NEct 세포는 상당한 양으로 확장 될 수있을뿐만 아니라 쉽게 동결 보존 될 수 있기 때문에이 접근법은 실험 간의 재현성을 향상시킵니다. 또한 Bioreactors 및 유사한 기술의 사용을 채택 한 다른 프로토콜과 비교할 때이 프로토콜에는 특수 장비가 필요하지 않으므로 모든 실험실6에 적합합니다. 마지막으로, SATB2와 같은 피질층 마커에 양성인 성숙한 오가노이드를 생성하는 데 필요한 시간은 랭커 스터1 및 생물반응기 프로토콜 6,19에 비해 감소되어 건강 및 질병 1,6,16에서 인간 피질 발달의 발달 궤적을 연구하는 데 더 적합합니다.
또한, 병인에 기여하는 뇌의 노화 세포 유형의 증가와 관련된 치매와 같은 노화 관련 질병의 지속적인 글로벌 건강 관리 영향을 감안할 때, 뇌 노화를 개선 할 수있는 화합물을 확인하고 테스트하는 능력은 엄청난 관심사입니다. hPSCs가 리프로그래밍 과정(20) 동안 후성 유전학적으로 젊어지는 것으로 알려져 있음에도 불구하고, 우리는 장기간 배양 된 피질 뇌 오가노이드에서 노인성 세포의 강력한 증가를 발견한다. 이것은 이제 뇌에서 그러한 노화 세포를 제거하는 약물 (senolytics)을 가능하게하거나이 과정을 늦추는 약물 (senostatics)21을 가능하게하는 유망한 개발입니다. 인간 NEct 유래 피질 뇌 오가노이드는 인간 기원이기 때문에,이 접근법은 그러한 새로운 치료제를 시장에 내놓는 전통적인 경로를 단축시킬 것입니다.
이 프로토콜에는 두 가지 중요한 단계가 있습니다. 첫 번째는 분화 당시의 hPSC 콜로니의 정확한 컨플루언시 수준이다. hPSC 콜로니는 생성 된 NEct 식민지가 이웃 식민지와 융합되지 않고 개별 오가노이드가 clonally 구동되도록하기 위해 최대 30 % 합류해야합니다. 두 번째 중요한 단계는 NEct 콜로니를 들어 올리고 신경 구상체를 생성하기 위해 dispase를 올바르게 사용하는 것입니다. dispase로 인큐베이션하는 타이밍은 생성 된 신경 구상체의 최종 품질에 중요합니다. 이는 디스파아제를 사용한 콜로니의 과다 노출이 세포(22 )에 독성이 있고 결국 생성된 오가노이드의 품질에 영향을 미치기 때문이다. 이 프로토콜의 한계는 dispase로 들어 올려지는 초기 콜로니의 크기에 의존하기 때문에 신경 구상체의 크기를 제어하기가 어렵다는 것입니다. 그러나이 문제는 임베딩 단계로 진행할 때 비슷한 크기의 신경 구상체를 선택하여 극복 할 수 있습니다.
마지막으로, 미래의 응용 프로그램은 로봇 분석 및 생물 약제 스크리닝 접근법에서 이러한 재현 가능한 피질 오가노이드의 사용으로 확장 될 수 있습니다. 이것은 인간 NEct 세포에서 피질 뇌 오가노이드의 생성이 쉽게 자동화 될 수 있음을 나타내는 실험실의 예비 데이터에 의해 뒷받침되며, 이러한 접근법과 호환 될 수 있습니다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 의학 연구 미래 기금 가속 연구, 백혈구 이영양증 주력 마시모 사명 (EPCD000034), 의학 연구 미래 기금 – 줄기 세포 임무 (APP2007653)에 의해 지원됩니다. 저자는 보충 비디오 1에서 데이터를 생성 한 이주현 박사 (고려대학교)에게 감사하고 싶습니다.
16% Formaldehyde (W/V) Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | 4% of PFA are diluted in 1x PBS |
2-Mercaptoethanol 50 mL(1000x) | Life Technologies Australia (TFS) | 21985023 | Used in NM and DM media |
B 27 Supplement 10 mL | Life Technologies Australia (TFS) | 17504044 | Used in NM and DM media |
CKX53 microscope with SC50 camera | Olympus | ||
Corning Costar 6 well cell culture plates | Sigma Aldrich Pty Ltd | CLS3516-50EA | |
Dispase II powder | Thermo Fisher Scientific | 17105041 | Powder is dissolve in HBSS, filtered through 0.22 µm filter, aliquote at 10 mL and store at -20 °C |
DMEM Nutrient Mix F12 10x 500 mL (DMEM/F-12) | Thermofisher | 11320082 | Used in NM and DM media |
DMSO Dimethyl Sulfoxide | Sigma Aldrich Pty Ltd | D2650-100ML | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich Pty Ltd | D1408-500ML | |
Falcon Matrigel hESC-qualified Matrix | In Vitro Technologies Pty Ltd | FAL354277 | Make aliquotes of 100 µL and stored at -20 °C |
GlutaMAX Supplement 100x | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Used in NM and DM media |
Hanks Balanced Salt Solution | Sigma Aldrich Pty Ltd | H8264 | |
Human induced pluripotent stem cells (EU79) | In-house reporogrammed from skin fibroblast | ||
Human induced pluripotent stem cells (G22) | Genea Biocells | Obtained from Genea Biocells (San Diego, United States) | |
Human induced pluripotent stem cells (WTC) | Gift from Professor Bruce Conklin | ||
InSolution TGF-Β RI Kinase Inhibitor VI, SB431542 | Merck | US1616464-5MG | |
Insulin Solution Human Recombinant | Sigma Aldrich Pty Ltd | I9278 | Used in NM and DM media |
LDN193189 Dihydrochloride | Sigma Aldrich Pty Ltd | SML0559-5MG | Used during differentiation |
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100x) | Thermo Fisher Scientific | 11140050 | Used in NM and DM media |
mTeSR Plus | STEMCELL TECHNOLOGIES | 100-0276 | Used to maintain hiPSC colonies prior to differentiation with NM media |
N2 Supplement 5 mL (100x) | Life Technologies Australia Pty Ltd | 17502048 | Used in NM and DM media |
Neurobasal Medium | Thermo Fisher Scientific | 21103049 | Used in DM media |
OCT Embedding Compound Sakura Clear (118 mL/Bottle) | Tissue Tek | 4583 | |
Parafilm M Roll Size 4 in. x 125 Ft | Sigma Aldrich Pty Ltd | P7793 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used in NM and DM media |
Potassium Hexacyanoferrate (II) Trihydrate | Sigma Aldrich Pty Ltd | CP1087 | |
Potassium hexacyanoferrate(III) | Sigma Aldrich Pty Ltd | 455946 | |
Prolong Glass Antifade Mountant | Life Technologies Australia (TFS) | P36980 | |
Recombinant Human FGF basic | R&D Systems | 233-FB-01M | Aliquotes are made at 20 µg/mL and stored at -20 °C |
SB431542 | Tocris | 1614 | Used during differentiation |
Sucrose | Sigma Aldrich Pty Ltd | PHR1001-1G | 30% of sucrose are diluted in 1x PBS |
Ultra-Low attachment multiwell plates , 24 well plate, polystyrene | Sigma Aldrich Pty Ltd | CLS3473-24EA | |
X-GAL EA | Life Technologies Australia (TFS) | R0404 | Make aliquotes of 20 mg/mL and storde at -80 °C |