Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy

Alejandro De la Cadena; Federico Vernuccio; Benedetta Talone; Arianna Bresci; Chiara Ceconello; Subir Das; Renzo Vanna; Giulio Cerullo; Dario Polli

doi:10.3791/63709

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Engenharia

Imagerie chimique multiplex basée sur la microscopie à diffusion Raman stimulée à large bande

Published: July 25, 2022

doi:

10.3791/63709

Alejandro De la Cadena¹, Federico Vernuccio¹, Benedetta Talone¹, Arianna Bresci¹, Chiara Ceconello¹, Subir Das¹, Renzo Vanna², Giulio Cerullo^1,2, Dario Polli^1,2

¹Dipartimento di Fisica,Politecnico di Milano, ²Institute for Photonics and Nanotechnologies (IFN-CNR)

Summary

Nous présentons un protocole pour acquérir des images chimiques avec la microscopie à diffusion Raman stimulée à large bande (SRS). Basé sur un microscope SRS qui fonctionne avec une détection différentielle multicanal, le protocole décrit la préparation de l’échantillon, l’ajustement de l’appareil SRS et la chimiométrie pour démêler différents constituants d’échantillons chimiquement hétérogènes.

Abstract

La microscopie à diffusion Raman stimulée (SRS) est une technique optique non linéaire pour l’imagerie chimique sans étiquette. Cet outil analytique fournit des cartes chimiques à grande vitesse et une résolution spatiale élevée d’échantillons minces en interrogeant directement leurs vibrations moléculaires. Dans sa mise en œuvre standard, la microscopie SRS est à bande étroite et forme des images avec une seule fréquence vibratoire à la fois. Cependant, cette approche non seulement entrave la spécificité chimique du SRS, mais néglige également la richesse des informations codées dans les spectres vibratoires.

Ces limitations peuvent être surmontées par le SRS à large bande, une implémentation capable d’extraire un spectre vibratoire par pixel de l’image en parallèle. Cela fournit des données hyperspectrales qui, lorsqu’elles sont associées à une analyse chimiométrique, maximisent la quantité d’informations extraites de l’échantillon. Ainsi, le SRS à large bande améliore la spécificité chimique du système, permettant la détermination quantitative de la concentration des différents constituants d’un échantillon. Ici, nous rapportons un protocole d’imagerie chimique avec microscopie SRS à large bande, basé sur un microscope SRS fabriqué à la maison fonctionnant avec une détection d’amplificateur différentiel multicanal personnalisé. Il traite de la préparation de l’échantillon, de l’alignement de l’appareil SRS et de l’analyse chimiométrique. En acquérant des spectres Raman vibratoires, le protocole illustre comment identifier différentes espèces chimiques dans un mélange, en déterminant leurs concentrations relatives.

Introduction

La microscopie Raman est une technique d’imagerie puissante qui fournit de riches cartes chimiques en mesurant la diffusion Raman¹, un processus radiatif inélastique qui provient de molécules vibrantes en réponse à la lumière incidente ^2,3. Chaque pixel d’une carte Raman contient un spectre qui transporte des informations directes sur la composition chimique et la structure de l’échantillon, ce qui donne des images avec un contraste vibratoire intrinsèque. À ce jour, la microscopie Raman est le point de vue de référence pour les études de microspectroscopie des vibrations moléculaires, car aucune autre technique d’imagerie ne peut produire des images à la fois avec une spécificité chimique élevée et une résolution spatiale élevée⁴. Malgré sa spécificité chimique exceptionnelle, l’efficacité de génération de la diffusion Raman est faible, ce qui nécessite soit des temps de séjour prolongés des pixels, soit une excitation de haute puissance, entraînant respectivement de faibles taux d’acquisition et une incompatibilité avec des échantillons sensibles.

Cette seule déficience de la microscopie Raman a conduit les chercheurs à appliquer la diffusion Raman cohérente ^5,6,7,8,9 comme source de contraste pour la microscopie. Il s’agit d’un processus optique non linéaire qui améliore la réponse vibratoire de plusieurs (jusqu’à sept) ordres de grandeur, permettant ainsi une imagerie chimique à grande vitesse 10,11,12,13. En particulier, les deux techniques de diffusion Raman cohérente les plus utilisées sont la diffusion Raman anti-Stokes cohérente (CARS)¹⁴ et la diffusion Raman stimulée (SRS)¹⁵. Contrairement à CARS, SRS montre une dépendance linéaire à la concentration de molécules résonnantes. Il est immunisé contre le fond non résonant, un effet non linéaire sans rapport avec une transition vibratoire mais déformant les formes lorentziennes caractéristiques des spectres Raman des vibrations moléculaires^16,17. Ainsi, la microscopie SRS produit des informations Raman authentiques qui permettent une analyse quantitative directe de l’image.

SRS est un processus optique non linéaire de troisième ordre qui fournit des informations directes sur les liaisons chimiques d’un échantillon. Elle provient de la superposition spatio-temporelle de deux champs optiques généralement dans la région spectrale proche infrarouge, à savoir la pompe et les Stokes à la fréquence ω_pu et ω_S, respectivement 10,11,18. Cette superposition génère un battement au désaccordage de fréquence pompe-Stokes Ω = ω_pu-ω _S. Lorsque Ω correspond à une vibration moléculaire Ω_R, la molécule résonne, provoquant un transfert d’énergie cohérent entre les champs lumineux et la molécule. En conséquence, la molécule atteint un état vibratoirement excité. Ce processus peut être surveillé en mesurant soit l’annihilation des photons de la pompe (un signal connu sous le nom de perte Raman stimulée [SRL]) ou l’amplification concomitante des photons de Stokes (un processus connu sous le nom de gain Raman stimulé [SRG]). SRG et SRL sont de petits signaux (ΔI) qui se trouvent au-dessus d’un arrière-plan intense et fluctuant (I). Comme les valeurs typiques du signal SRS (ΔI/I) sont dans la gamme 10-6-10-4, le bruit laser peut facilement l’obscurcir. Pour atténuer les effets néfastes du bruit laser sur le rapport signal/bruit (SNR) et, par conséquent, sur la vitesse d’imagerie, la détection SRS repose sur des techniques de transfert de modulation (par exemple, des amplificateurs de verrouillage, des circuits de résonance ou des moyenneurs de wagons-boîtes) à des fréquences de modulation élevées (>1 MHz), où le bruit laser atteint ses valeurs minimales 15,19,20.

La microscopie SRS conventionnelle utilise une pompe à bande étroite (≈10 cm⁻¹) et des impulsions de Stokes pour produire des images chimiques à une seule fréquence vibratoire, permettant une imagerie à débit vidéo avec des temps de séjour en pixels aussi bas que ≈100 ns^21,22. Cependant, comme la microscopie SRS à bande étroite forme des cartes chimiques en scannant séquentiellement l’échantillon à seulement quelques fréquences vibratoires, ses informations sont limitées²³. Les images SRS avec un ou deux contrastes vibratoires peuvent ne pas suffire à différencier les espèces chimiques avec des bandes Raman qui se chevauchent, en particulier dans les systèmes hétérogènes. Par conséquent, le microscope SRS à bande étroite paradigmatique n’exploite pas tout le potentiel du SRS, car l’étude d’une poignée de fréquences vibratoires entrave sa spécificité chimique et néglige la richesse des informations codées dans les spectres vibratoires. De plus, le balayage séquentiel de l’échantillon à différentes fréquences entraîne des temps de séjour prolongés des pixels qui peuvent déclencher des photodommages et empêcher un corsage spatial rigoureux entre des images consécutives, conduisant à des artefacts de mouvement.

Contrairement à son homologue à bande étroite, la microscopie SRS à large bande récupère un spectre vibratoire par pixel à chaque balayage d’échantillon 10,12,24. Ainsi, le SRS à large bande fournit une imagerie hyperspectrale avec un enregistrement spatial strict des différents contrastes vibratoires, permettant une analyse rigoureuse des données. Cela révèle non seulement les constituants chimiques de l’échantillon à travers les spectres Raman, mais aide également à déterminer leurs concentrations relatives. Selon la façon dont les spectres sont acquis, la microscopie SRS à large bande est classée soit comme SRS hyperspectrale, soit srS multiplex. Dans le SRS hyperspectral, le spectre SRS par point scanné de l’échantillon est acquis séquentiellement (c’est-à-dire qu’il est récupéré en balayant le désaccordage de fréquence Ω), construisant un spectre SRS en empilant les signaux SRS lors de décalages Raman consécutifs. Le spectre Raman est mesuré simultanément à plusieurs modes vibratoires dans le SRS multiplex. Ainsi, l’approche SRS multiplex combine une impulsion modulée en bande étroite avec une impulsion à large bande pour piloter le signal SRS à différentes fréquences, et utilise un détecteur multicanal avec une sensibilité comparable à celle du SRS à bande étroite pour détecter les spectres SRS.

Cet article présente un protocole pour produire des cartes chimiques d’échantillons hétérogènes en utilisant la microscopie SRS multiplex. Un schéma du microscope SRS utilisé dans ce protocole est représenté à la figure 1 et décrit en détail ailleurs 25,26,27. En bref, un laser à fibre Yb à verrouillage de mode commercial, produisant des impulsions de 140 fs centrées à 1040 nm, avec une puissance moyenne de 10 W et un taux de répétition de 80 MHz, pilote le microscope SRS à large bande. Un séparateur de faisceau polarisant (PBS) sépare le faisceau fondamental en deux branches. Pour produire les impulsions de Stokes à bande étroite, une branche avec 4 W du faisceau fondamental est envoyée à un étalon qui génère un faisceau à bande étroite (≈15 ^cm-1), qui est ensuite modulé à 1,6 MHz avec un modulateur optique acoustique (AOM). La fraction restante avec 6 W du faisceau fondamental est doublée de fréquence avec un cristal de triborate de lithium (LBO) de 2,8 mm d’épaisseur, coupé pour l’appariement de phase de type I (θ = 90°, φ = 13,8°). La deuxième génération harmonique résultante à 520 nm se déplace vers une cavité pliée en X pour pomper un oscillateur paramétrique optique (OPO), un dispositif qui utilise un cristal LBO de 3,0 mm d’épaisseur (correspondance de phase de type I, θ = 90 °, φ = 9,8 °) comme milieu actif pour délivrer un rayonnement optique à large bande accordable dans la région spectrale 680-910 nm (Figure 2). Ces impulsions à large bande servent de pompe dans les expériences SRS et se propagent à un compresseur à prisme pour précompenser les effets de dispersion induits par l’objectif du microscope.

Après l’étape de compression, une plaque d’onde λ/2, combinée à une plaque biréfringente YVO₄ , produit deux répliques orthogonalement polarisées dont la soustraction électronique au plan de détection annule le bruit de la pompe à large bande. Un miroir dichroïque combine la pompe et les faisceaux de Stokes et les envoie à un microscope vertical. Un objectif d’immersion dans l’eau avec une ouverture numérique (NA) de 1,27 concentre la lumière sur l’échantillon, tandis qu’un objectif d’immersion dans l’huile avec un NA de 1,4 la recueille. Avant l’étape de détection, un filtre passe-court (FPS) élimine les Stokes modulés, tandis qu’un réseau de diffraction fonctionnant en configuration Littrow disperse la pompe à large bande transmise. Un deuxième PBS₂ sépare les répliques de pompe et un objectif les concentre sur deux réseaux de photodiodes. Les signaux de ces réseaux de photodiodes sont soustraits électroniquement et envoyés à un amplificateur multicanal (M-LIA) construit à la maison. Le signal démodulé est ensuite normalisé par les lectures de courant continu (DC) de l’un des réseaux de photodiodes, produisant ainsi le spectre SRL.

À titre d’expérience exemplaire, nous imageons des mélanges de plusieurs diffuseurs Raman bien connus, chacun avec un spectre Raman unique. Ainsi, le protocole commence par décrire comment préparer les échantillons de référence. Au fur et à mesure que nous détectons SRL, nous continuons à expliquer comment obtenir des impulsions Stokes à bande étroite et configurer la source optique qui délivre les impulsions de pompe à large bande (≈250 ^cm-1), à savoir l’OPO maison. Le protocole montre l’alignement et l’optimisation des faisceaux optiques, décrivant des paramètres critiques tels que la puissance et les spectres de la Stokes à bande étroite et de la pompe à large bande. Le protocole décrit en détail le chemin optique de la pompe à large bande car il nécessite des éléments optiques spéciaux. Il explique également comment trouver le chevauchement spatio-temporel entre les impulsions pump-Stokes et montre un moyen pratique de déterminer le bruit d’intensité relative (RIN), qui à son tour aide à définir la meilleure fréquence de modulation pour les expériences SRS. Ensuite, nous expliquons le principe de fonctionnement et l’étalonnage de la chaîne de détection. Enfin, le protocole montre le processus d’acquisition de données, la chimiométrie et le pipeline de traitement d’images.

Protocol

1. Préparation de l’échantillon NOTE: Ce protocole décrit la récupération des cartes de concentration et des spectres SRS caractéristiques de mélanges chimiquement hétérogènes. Pour préparer l’échantillon, extraire 2 μL d’une suspension aqueuse de microbilles de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) (voir la table des matériaux) et verser la fraction de 2 μL sur un couvercle de microscope. Avec une pointe de pipette propre, extraire 2 μL d’une suspension aqueuse de microbilles de polystyrène (PS) et la combiner avec la suspension PMMA sur le couvercle. À l’aide d’une pointe de pipette, mélanger doucement la suspension et laisser sécher pendant 24 h.REMARQUE: Il est important de faire correspondre soigneusement la concentration des suspensions de microbilles pour éviter des quantités disproportionnées de microbilles sur la surface de l’échantillon. Le diamètre des billes PS et PMMA est respectivement de 10 et 6 μm. Ces dimensions permettent de démontrer la haute résolution spatiale du microscope sans compromettre l’efficacité de génération de SRS. Sur le dessus de la couche plate et blanche de perles qui apparaîtra lorsque l’eau se dessèchera, ajoutez 20 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO), puis 20 μL d’huile d’olive pure. Appliquez du vernis à ongles sur les bords d’un deuxième couvercle de microscope. Placez le couvercle sur le mélange, avec le vernis à ongles tourné vers le bas, en appliquant suffisamment de pression pour le sceller. Laissez sécher.REMARQUE : La figure 3 montre des résultats exemplaires obtenus avec ces étapes. S’il est correctement scellé, cet échantillon devrait durer jusqu’à trois mois. 2. Optimisation des pompes et des faisceaux Stokes Allumez le laser et laissez-le atteindre l’équilibre thermique. Appliquer une dispersion de retard de groupe négative (GDD) de GDD = -6 000 fs2 au faisceau fondamental.REMARQUE: Cette valeur GDD est essentielle pour piloter avec succès l’OPO et est optimale pour cette configuration, mais varie probablement selon les systèmes. Le GDD négatif peut être introduit par des paires de caillebotis, des compresseurs à prisme ou des façonneurs d’impulsions basés sur des modulateurs de lumière spatiaux28. Divisez le laser fondamental avec un séparateur de faisceau polarisant (PBS1) en deux branches. Pour obtenir les impulsions stokes à bande étroite, guidez une branche de 4 W vers un étalon. Faites légèrement pivoter l’étalon jusqu’à ce qu’une raie spectrale étroite soit obtenue et centrée au sommet du spectre d’impulsions (voir la courbe rouge de la figure 2).REMARQUE: Cet étalon a une finesse effective de 29 et une gamme spectrale libre de 29,8 nm à 1 040 nm. Pour obtenir des impulsions de Stokes modulées, envoyez le faisceau à bande étroite à un modulateur acousto-optique.REMARQUE: Comme le montre la figure 4A, le faisceau diffracté de premier ordre subit une modulation de 100%, tandis que le zéro d’ordre n’est que de 50%. Par conséquent, il est préférable d’utiliser le premier ordre pour éviter d’éclairer l’échantillon avec un fort faisceau non modulé qui peut induire des photodommages de l’échantillon sans générer de signal SRS. Pour optimiser l’efficacité de modulation, modifiez la distance entre les objectifs f1 et f2 (Figure 4B). Mesurez le faisceau modulé avec une photodiode et enregistrez son profil avec un oscilloscope. Modifiez la distance entre f1 et f2 jusqu’à ce qu’un contraste maximal soit atteint entre l’amplitude et la ligne de base des lectures de l’oscilloscope.REMARQUE: Cette paire de lentilles ne fonctionne pas comme un collimateur, mais crée plutôt un point focal efficace au niveau du cristal de l’AOM. Placez une troisième lentille f3 pour affiner la taille du faisceau de Stokes, ce qui permet de modifier le volume d’interaction au plan focal du microscope et, par conséquent, d’optimiser le signal SRS.REMARQUE: Le faisceau de Stokes a été modulé à 1,6 MHz dans ce protocole. Focaliser les 6 W restants de la puissance optique du faisceau fondamental sur un cristal de triborate de lithium (LBO) (LBO1, θ = 90°, φ = 13,8°) pour doubler la fréquence du faisceau fondamental par la deuxième génération harmonique (SHG) (Figure 5A). Pour maximiser l’efficacité du SHG, faites légèrement pivoter le cristal en faisant varier l’angle de φ (Figure 5B). Optimisez le LBO1 pour obtenir au moins 2,5 W de SHG. Ajustez l’angle de φ du LBO2 pour maximiser l’efficacité de génération du faisceau de signal.REMARQUE: Les distances focales des objectifs f1, f2 et f3 ont été soigneusement choisies pour faire correspondre le faisceau SHG avec la cavité OPO. Ainsi, les distances focales de ces objectifs varieront selon les configurations. En raison de la dispersion résiduelle dans la cavité OPO, un léger changement dans la longueur de la cavité induit un déplacement du spectre du faisceau de signaux. Ajustez la longueur de la cavité pour obtenir un spectre de pompe qui, avec le Stokes à bande étroite à 1 040 nm, peut produire un désaccordage de fréquence dans les 1 373-5 090 cm-1. Cette plage couvre les vibrations dans la région spectrale d’étirement CH (2 800-3 050 cm-1). Voir les spectres bleus à la figure 2. Pour compenser les effets de dispersion induits par l’objectif du microscope d’excitation, envoyez la pompe à large bande à un compresseur à prisme. Entrez la pompe dans le prisme A par son sommet et guidez la pompe dispersée vers le sommet du prisme B. Définissez la quantité de dispersion négative nécessaire, puis définissez la distance entre les apices L des prismes en conséquence.REMARQUE: La figure 6 montre la disposition des prismes29. Dans ce cas, l’indemnisation a été fixée pour GDD ≈ -12 800 fs2; d’où L = 1,26 m. Utilisez des prismes coupés Brewster. Assurez-vous que la polarisation du faisceau de la pompe se trouve dans les plans triangulaires des prismes (faces supérieures/inférieures non polies). Assurez-vous que l’angle d’incidence θ dans le faisceau de la pompe correspondà l’angle de Brewster. Assurez-vous que la face de sortie du prisme A est parallèle à la face d’entrée du prisme B. Pour estimer le GDD de l’impulsion à large bande à compenser, mesurer le signal SRS à une seule longueur d’onde λ1, en enregistrant le délai τ1 entre les Stokes de la pompe auxquels le SRS maximal (λ1) est obtenu. Répétez cette procédure pour une deuxième longueur d’onde λ2, en enregistrant à nouveau le délai τ2 auquel le SRS(λ2) était maximal.NOTE: Étant donné que le GDD est défini comme la dérivée du retard de groupe par rapport à la fréquence angulaire, les mesures susmentionnées permettent d’estimer le GDD du faisceau à large bande (Eq [1]).(1) À l’aide d’une plaque d’onde λ/2, réglez la polarisation du faisceau de la pompe à 45°. Guidez la pompe polarisée vers une plaque YVO4 d’une longueur de 13,3 mm, en réglant l’axe rapide de ce cristal biréfringent à la verticale.REMARQUE: En traversant la plaque YVO4 , les impulsions de la pompe seront divisées en deux répliques orthogonalement polarisées se propageant colinéairement mais en gardant un délai de Δt ≈ 10 ps entre elles. Ce délai est fonction de l’épaisseur et des indices de réfraction du cristal biréfringent. Ci-après, les répliques de pompe avec le même état de polarisation des impulsions de Stokes seront appelées « signal » tandis que celles avec un état orthogonal comme « référence ». Les détails de cette technique, appelée détection équilibrée en ligne, ont été décrits précédemment30. Combinez la pompe et les faisceaux de Stokes avec un miroir dichroïque et alignez-les soigneusement à l’aide d’une paire de sténopés fluorescents, en veillant à ce que les deux se propagent colinéairement. Atténuez les faisceaux et utilisez un objectif pour les focaliser sur une photodiode rapide (bande passante d’au moins 100 MHz). Bloquez la pompe et mesurez des impulsions Stokes simples avec un oscilloscope numérique à large bande passante. Utilisez le signal de déclenchement du laser comme source d’horloge pour les mesures de l’oscilloscope. Déterminez la valeur moyenne à laquelle la tension de la photodiode atteint son maximum. Bloquez le faisceau de Stokes et répétez cette procédure pour les impulsions de la pompe. Augmentez ou réduisez le trajet optique du faisceau de la pompe (Stokes) jusqu’à ce que ses impulsions arrivent à peu près en même temps que les impulsions de Stokes (pompe).REMARQUE: Cela devrait garantir une précision de quelques millimètres au maximum dans l’appariement de la différence de chemin optique entre les deux bras. Retirez la photodiode et placez un cristal non linéaire avec un angle de coupe approprié pour la génération de fréquence de somme (SFG) entre les photons de stokes de la pompe.REMARQUE: Le cristal non linéaire utilisé ici a été coupé pour l’appariement de phase de type I, θ = 90 °, φ = 9,8 °. L’axe optique du cristal non linéaire doit être parallèle à la polarisation des impulsions de Stokes et de signal. Rendez les faisceaux pompe/Stokes légèrement non collinéaires et déplacez la ligne de retard jusqu’au SFG, un signal qui, en raison de l’appariement des phases, se trouve entre les SHG de la pompe et les faisceaux Stokes. Si le signal est introuvable, vérifiez le chevauchement spatial des deux faisceaux sur le cristal.REMARQUE: Le SFG est décalé en bleu et doit être facilement visible à l’œil nu. En cas de difficultés inattendues, placez un filtre passe-bas pour retirer la pompe et stokes et leurs SHG respectifs et mesurez le SFG avec un spectromètre (Figure 7A). Trouvez le délai auquel le SFG atteint son intensité maximale, une valeur qui détermine le chevauchement spatio-temporel idéal requis pour la génération de signaux non linéaires, et fixez-y la ligne de retard (Figure 7B). Mesurez les profils de faisceau avec une caméra calibrée. Vous pouvez également utiliser une carte infrarouge et estimer les diamètres à l’œil. Utilisez deux télescopes, l’un pour la pompe et l’autre pour le faisceau de Stokes. Avec ces télescopes, essayez de faire correspondre les diamètres de faisceau à l’ouverture arrière de l’objectif d’excitation.REMARQUE: Cette procédure garantira la résolution spatiale maximale de la configuration. Une fois le signal SRS obtenu, utilisez le télescope sur le faisceau de la pompe pour ajuster son diamètre, en faisant varier sa portée de Rayleigh et, par conséquent, le volume d’interaction au foyer du microscope. Arrêtez-vous lorsque le SRS maximal est atteint. Utilisez une photodiode pour mesurer l’intensité du faisceau de la pompe (Stokes) et, avec la réceptivité de la photodiode, calculez la puissance moyenne qui empiète sur la zone active du détecteur. Si vous utilisez une photodiode à large bande passante, connectez un filtre passe-bas électronique pour obtenir uniquement le composant constant ou CC. Pour mesurer δP(f), connectez la sortie d’une photodiode à large bande passante (déconnectez le filtre passe-bas) à l’entrée d’un amplificateur verrouillable. Stockez la sortie de verrouillage à différentes fréquences de démodulation et utilisez la réceptivité de la photodiode pour convertir de V en W.REMARQUE: Les amplificateurs à verrouillage commerciaux ont des outils intégrés pour mesurer δP (f) (par exemple, Zurich Instruments incorporé à LabOne a Frequency Sweeper31).. Après avoir mesuré le RIN des faisceaux, éteignez le laser et mesurez le bruit électronique (c’est-à-dire le RIN calculé sans aucune lumière sur les détecteurs).REMARQUE: À condition que le RIN soit limité par les fluctuations du laser et non par le bruit de tir, cette mesure sombre aidera à diagnostiquer l’instrumentation utilisée pour les mesures; si le bruit électronique est aussi élevé que le RIN du laser, cela ne peut pas être utilisé pour mesurer le RIN du laser; Il peut être nécessaire d’utiliser des amplificateurs à très faible bruit pour réduire le bruit électronique. Si le RIN est limité par le bruit de tir et non par la fluctuation du laser, faites briller plus de puissance optique sur le détecteur. Voir la figure 8. 3. Configuration de la détection spectrale pour l’imagerie SRS Guidez la pompe et les faisceaux stokes vers le microscope. Placez l’échantillon décrit à la section 1 et trouvez une région sans billes pour aider à aligner le faisceau de la pompe. À l’aide d’une caméra, mesurez le profil réfléchi du faisceau Stokes (pompe) tout en bloquant la pompe (Stokes). Ajustez les positions des points laser avec les miroirs juste avant le microscope.REMARQUE: Pour obtenir la génération SRS la plus élevée, ils doivent parfaitement se chevaucher. La figure 9 montre (A) la pompe, (B) Stokes et (C) les deux faisceaux parfaitement superposés au plan focal du microscope. Rendre les objectifs d’excitation et de collecte confocaux.REMARQUE: L’utilisation d’objectifs corrigés à l’infini signifie que la focalisation de la pompe sur le plan de l’échantillon entraînera un faisceau collimé à l’ouverture arrière de l’objectif de collecte. Mettez un filtre passe-court pour retirer les Stokes modulés et guidez le faisceau de la pompe vers le caillebotis. Placez une lentille après le réseau pour focaliser le faisceau dispersé sur les détecteurs.REMARQUE: L’équation de grille aidera à déterminer la dispersion linéaire (c’est-à-dire combien de nm par mm au plan du détecteur avec une lentille d’une distance focale donnée f32). L’équation de caillebotis relie la périodicité de la rainure d du réseau, l’angle d’incidence α, l’angle de diffraction β, la longueur d’onde diffractée λ et l’ordre de diffraction m (Eq [2]). (2) Pour une détection équilibrée, mesurez le spectre de la référence et les répliques de signaux se propageant le long du faisceau de la pompe.REMARQUE: Le profil spatial du faisceau de pompe après le réseau est une ligne comprenant les différentes composantes spectrales de la pompe à large bande sur toute sa longueur. Chaque composante spectrale de la ligne de pompe sera focalisée à la distance f par une lentille sphérique (voir étapes 3.1-3.2). Pour éviter de couper la pompe dispersée, placez la lentille sphérique aussi près que possible du caillebotis. Placez un PBS juste après la lentille sphérique pour séparer les répliques de pompe.REMARQUE: Ici, un séparateur de faisceau cubique polarisant a été utilisé car ce type de polariseur ne brouille pas la polarisation du faisceau de la pompe. Il sépare également efficacement les différentes répliques de pompe et peut être assez grand pour éviter d’écrêter la pompe à large bande. Le PBS reflétera la réplique du signal (polarisée s) et transmettra la réplique de référence (polarisée p). À l’aide d’une paire de rétroviseurs de direction, guidez le signal et la référence à leurs détecteurs respectifs (Figure 1).REMARQUE: Dans la configuration équilibrée idéale, les réplicas de signal et de référence doivent avoir la même puissance optique. Pour éliminer le bruit dans le faisceau de la pompe, corrélez les canaux du réseau de photodiodes mesurant le signal avec leurs homologues du détecteur de référence. Par conséquent, assurez-vous que lan-ième photodiode des réseaux de photosdiodes de signal et de référence mesure la puissance optique de la même composante spectrale du signal et des répliques de référence.REMARQUE : La figure 8 montre des spectres RIN exemplaires. Pour garantir l’appariement spectral entre les deux réseaux de photodiodes, placez une petite fente ou un iris entre le réseau et le PBS pour filtrer spatialement la pompe dispersée. Coupez tous les composants spectraux sauf un des répliques de pompe pour centrer les rayons transmis sur lenième détecteur des réseaux de photodiodes de référence et de signal. Utilisez les rétroviseurs de direction mentionnés pour ajuster la corrélation des différents canaux de détection. À ce stade, commencez la microscopie SRS. Pour ce faire, modulez les Stokes, scannez l’échantillon et acquérez le transfert de modulation sur le spectre de la pompe (ΔI) avec son spectre CC (I) correspondant pour obtenir le spectre SRS normalisé (ΔI / I) de chaque pixel. Produire des matrices tridimensionnelles dont les lignes (x) et les colonnes (y) contiennent les positions numérisées de l’échantillon. Sur chaque vecteur (z) orthogonal au plan x-y, stockez un spectre SRS.REMARQUE : La figure 12 montre la structure des données hyperspectrales SRS. Réglez la puissance du faisceau Stokes à 65 mW et celle du faisceau de la pompe à large bande à 20 mW. Définissez un moment d’intégration idéal pour les expériences.REMARQUE: Ici, le temps d’intégration était de 44 μs; cependant, le temps de séjour des pixels était de 1 ms en raison de la lenteur du scanner piézoélectrique. 4. Chimiométrie des données SRS hyperspectrales Utilisez l’analyse de résolution de courbe multivariée pour démêler les différents constituants chimiques de l’échantillon. Téléchargez l’interface graphique à partir du lien dans Tauler, de Juan et Jaumot33.REMARQUE: Ici, le programme MATLAB MULTIvariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS) développé par Tauler et ses collègues a été utilisé34,35. Pour les applications de MCR-ALS aux données SRS, reportez-vous à 36,37; pour des discussions détaillées sur l’algorithme, reportez-vous à la section 38. Dans MATLAB, remodelez le cube de données hyperspectrales SRS en une matrice D avec ses lignes contenant les spectres SRS. Supposons que l’hypercube D SRL déplié est une combinaison linéaire de la concentration C et des profils spectraux S des constituants chimiques de l’échantillon (c.-à-d. D = CS T + E, où E est une matrice qui contient l’erreur expérimentale et l’exposant T indique la transposition de la matrice). Obtenir les principaux composants des données pour séparer C et S. Comme on sait a priori que l’échantillon discuté à la section 1 contient quatre espèces, à savoir le DMSO, l’huile d’olive, le PMMA et le PS, configurez le programme pour rechercher quatre espèces plus une autre pour tenir compte du bruit de fond. S’il existe un échantillon différent avec un nombre d’espèces plus ou moins élevé, configurez le programme en conséquence.REMARQUE: Le programme effectue une décomposition à valeur singulière des données spectrales, en les utilisant comme premières suppositions des spectres purs S. Alternativement, alimentez le programme avec une matrice contenant les traces spectrales connues (par exemple, les spectres Raman spontanés des substances).REMARQUE : À l’aide des estimations initiales des spectres purs, le programme calculera C = DS(STS)−1 et ST = (CTC)−1CTD. Les nouvelles valeurs de C et S sont optimisées avec un algorithme alternant les moindres carrés. Comme SRS est un signal non négatif, contraignez l’algorithme des moindres carrés alternatifs à ne délivrer que des valeurs positives.REMARQUE: Les C et S optimisés permettront de construire une nouvelle matrice D * = CST, un ensemble de données que le programme comparera aux données D d’origine. Le programme itére automatiquement ces étapes jusqu’à ce que la différence entre D* et D soit inférieure à une valeur de seuil arbitraire qui peut être définie. Tracer C et S pour acquérir des images chimiques et les spectres caractéristiques des constituants chimiques de l’échantillon.

Representative Results

La figure 3 montre des résultats exemplaires obtenus en utilisant ce protocole avec PS, PMMA et huile d’olive. Cette rotation du LBO1 modifiera l’indice de réfraction ressenti par le champ SHG, modifiant directement sa vitesse de phase. Lorsque la vitesse de phase du champ SHG correspond à celle de la polarisation non linéaire induite dans LBO1, le champ généré non linéairement et la polarisation non linéaire seront en phase, ce qui entraînera un rayonnement SHG intense. En d’autres termes, le réglage de l’angle de φ de LBO1 permettra à l’utilisateur d’atteindre la condition idéale de correspondance de phase pour SHG. Comme un cristal correspondant à une phase de type I est utilisé ici, la polarisation du faisceau SHG sera orthogonale à celle du faisceau fondamental (figure 5B). La figure 8 montre le RIN des sources optiques utilisées dans ce protocole et la limite de bruit de tir, qui est une conséquence de la nature quantique des électrons et des photons qui fixe une limite fondamentale au bruit laser. Le RIN limité par bruit de tir est calculé avec comme indiqué par Eq (3). (3) Où h est la constante de Planck, et ν est la fréquence optique. Ainsi, le bruit de prise de vue fournit des directives utiles pour la conception électronique. La figure 11A et la figure 11C montrent des données exemplaires de spectres équilibrés et déséquilibrés. Naturellement, les effets de la détection équilibrée ont un impact sur les résultats finaux des expériences, à savoir les cartes chimiques. La figure 11B et la figure 11D montrent des images composites dans des conditions déséquilibrées et équilibrées, respectivement. La mise en œuvre réussie du protocole décrit aidera à identifier et à localiser les différents constituants chimiques d’un échantillon hétérogène et à extraire leurs spectres SRS caractéristiques. En soumettant les données hyperspectrales de la figure 12 à une analyse chimiométrique, on obtient la figure 13. La figure 13A montre un composite des cartes de concentration des différents constituants chimiques de l’échantillon, tandis que la figure 13B montre leurs spectres SRS caractéristiques. Notez que les données présentées à la figure 13A permettent non seulement à l’utilisateur d’identifier facilement les différents constituants de l’échantillon, mais aussi d’effectuer des analyses plus quantitatives. Par exemple, en utilisant les cartes de concentration, nous pourrions calculer la moyenne de la concentration fractionnée de chaque espèce chimique: 38% de DMSO, 25% de PMMA, 14% de PS et 22% d’huile d’olive. Figure 1 : Schéma du microscope SRS à large bande utilisé dans ce protocole. Abréviations: PBSx = séparateur de faisceau polarisant; SHG = deuxième module de génération harmonique; OPO = oscillateur paramétrique optique; AOM = modulateur optique acousto; SPF = filtre passe-court; M-LIA: Amplificateur de verrouillage multicanal; DM = miroir dichroïque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 2: Spectres de la pompe à large bande accordable (bleu) et des faisceaux stokes à bande étroite (rouge). Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Figure 3 : Image en champ clair de l’échantillon chimiquement hétérogène. Notez que la microscopie conventionnelle ne permet pas de distinguer les différents constituants. Barre d’échelle = 100 μm. Abréviations : PS = polystyrène; PMMA = polyméthacrylate de méthyle; DMSO = diméthylsulfoxyde. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 4: Modulation des impulsions de Stokes à bande étroite. (A) La trace bleue transparente montre le 0ème faisceau diffracté, tandis que la trace noire montre le1er ordre correspondant. (B) Configuration optique pour optimiser l’efficacité de modulation du faisceau diffracté de1er ordre et réglage fin de la taille du faisceau de Stokes avant d’arriver à l’objectif d’excitation. Abréviations : AOM = modulateur optique acousto ; fx = distance focale de l’objectif X. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure. Figure 5 : Processus optiques non linéaires requis pour piloter l’OPO. (A) Géométrie de l’interaction SHG. Deux photons fondamentaux à ω1 amènent le système matériel à un niveau virtuel de haute énergie, d’où le système matériel saute à l’état fondamental, émettant un photon à ωSHG. (B) Schéma de l’expérience SHG. (C) Un schéma des configurations SHG et OPO. (D) Géométrie de l’interaction DFG. Un photonSHG ω est divisé en photons de signal (signal ω) et de ralenti (ωIdler). Un gain du faisceau de signal est obtenu en renvoyant les photons du signal et en les faisant résonner dans la cavité. (E) Schéma de l’expérience DFG. Abréviations : SMx = miroir sphérique (R = 75 mm) ; OPO = oscillateur paramétrique optique; SHG = deuxième module de génération harmonique; DFG = génération de différence de fréquence; LBO = triborate de lithium; OC = condenseur d’huile; DM = miroir dichroïque; fx = distance focale de l’objectif X. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure. Figure 6 : Géométrie du compresseur à prisme. Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure. Figure 7 : Génération de fréquences de somme pour optimiser le chevauchement spatio-temporel. (A) SFG entre la pompe et Stokes et leur SHG respectif empiétant sur un écran. Ici, une lentille a focalisé la pompe et les faisceaux de Stokes sur le cristal, tandis qu’un filtre passe-bas les a retirés. (B) Intensité du SFG entre la pompe et Stokes en fonction du délai. Définissez le temps zéro de la configuration SRS à la position qui maximise le SFG. L’asymétrie de la corrélation croisée dans B est due au profil temporel causé par l’étalon sur le faisceau de Stokes. Abréviations : SFG = génération somme-fréquence ; SHG = deuxième module de génération harmonique; SRS = spectroscopie de diffusion Raman stimulée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 8 : Spectres RIN. La bande surlignée en vert montre la meilleure région spectrale pour les expériences SRS. La modulation du faisceau stokes à n’importe quelle fréquence de cette bande garantit que les effets du bruit laser sur le signal SRS seront les plus faibles possibles. Abréviations : RIN = bruit d’intensité relative; SRS = spectroscopie de diffusion Raman stimulée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 9: Profils des faisceaux. (A) Pompe, (B) Stokes, et (C) Pompe et Stokes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 10: Géométrie supposée d’un réseau de dispersion et d’un détecteur à réseau de photodiodes. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure. Graphique 11. Les effets de la détection équilibrée. Effets sur les spectres (A, C) et les images chimiques (B, D). Les composites présentés dans les panneaux (B) et (D) sont les résultats finaux des expériences (c’est-à-dire après analyse chimiométrique des données hyperspectrales). Voir la section 4 du protocole pour plus de détails). Barres d’échelle = 10 μm. Abréviation : SRS = spectroscopie de diffusion Raman stimulée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 12 : Un hypercube SRS représentatif acquis avec la microscopie SRS à large bande. Le plan x-y stocke les coordonnées des positions scannées, tandis que chaque vecteur le long de z enregistre un spectre SRS. Abréviation : SRS = spectroscopie de diffusion Raman stimulée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure. Figure 13: Analyse chimiométrique des données HYPERSPECTRAL SRS. (A) Composite des cartes de concentration des différents constituants de l’échantillon. B) Spectres caractéristiques des espèces chimiques. Dans les deux panneaux, jaune: huile d’olive, bleu: DMSO, cyan: PS et orange: PMMA. Barre d’échelle = 20 μm (A). Abréviations : SRS = spectroscopie de diffusion Raman stimulée ; PS = polystyrène; PMMA = polyméthacrylate de méthyle. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La microscopie SRS à large bande est une technique d’imagerie puissante qui offre un contraste chimique authentique pour identifier et démêler les constituants chimiques d’un échantillon hétérogène. Le potentiel de cet outil analytique peut être bénéfique pour plusieurs domaines de recherche, allant de la science des matériaux à l’histopathologie. L’inconvénient de la microscopie SRS à large bande est le fait qu’elle est techniquement exigeante; l’expérimentateur a non seulement besoin d’un savoir-faire sur les sources laser à large bande, mais doit également manipuler les impulsions laser pour générer efficacement srS, un signal qui, à son tour, doit être mesuré avec des schémas de détection sophistiqués. Cet article présente un protocole qui décrit un flux de travail pour produire des cartes chimiques de composés chimiques mélangés à l’aide d’un microscope SRS multiplex à large bande. Bien que les travaux décrits puissent être triviaux pour certains physiciens laser et microscopistes non linéaires, ce n’est peut-être pas le cas pour les lecteurs intéressés par les avantages de la microscopie SRS à large bande dont les connaissances scientifiques résident en dehors de ces domaines. Par conséquent, nous avons cherché à détailler chaque étape pour guider le large public intéressé par la microscopie SRS à large bande.

Le protocole en question a commencé par montrer comment préparer un échantillon simple mais riche en spectroscopie composé de plusieurs diffuseurs Raman forts et bien connus. Nous avons discuté de la façon d’obtenir la pompe à large bande et les faisceaux Stokes à bande étroite nécessaires à la mise en place d’un microscope SRS. La figure 5C montre un schéma des configurations SHG et OPO. Notez que la lentille f₁ focalise le faisceau fondamental sur le LBO₁ pour générer le SHG, tandis qu’un miroir dichroïque réfléchit le rayonnement SHG et transmet le faisceau fondamental résiduel. Une deuxième lentille f₂ collimale le faisceau SHG. Comme f₂> f₁, le faisceau SHG est élargi d’un facteur égal à f₂/f₁. Une troisième lentille f₃ focalise le faisceau SHG expansé sur un deuxième cristal LBO de type I (LBO₂) coupé à θ = 90° et φ = 29,0°. En pompant le LBO₂ avec le SGH susmentionné (520 nm), le rayonnement dans la plage de 680-910 nm émergera du LBO₂ par génération de fréquence de différence (DFG), produisant deux faisceaux: le signal et le ralenti²⁷ (Figure 5D, E). Ce dernier est jeté tandis que le premier est amplifié dans la cavité OPO pour délivrer les impulsions de pompe utilisées dans les expériences SRS. La pompe de l’OPO à 520 nm, à savoir le faisceau SHG, ne doit pas être confondue avec la pompe des expériences SRS (c’est-à-dire le faisceau de signal de l’OPO).

Le contraste en microscopie SRS provient d’un signal non linéaire généré au point focal du microscope, un signal qui exige de confiner un grand nombre de photons dans le plan de l’échantillon à un moment donné. Ce confinement des photons est réalisé avec un objectif de microscope à haute ouverture numérique (NA), un ensemble de lentilles qui définit également la résolution spatiale du système: plus le NA est élevé, plus la résolution spatiale est élevée. Cependant, les objectifs NA élevés sont densément remplis de verre, ce qui introduit un GDD positif au rayonnement pulsé, un gazouillis de fréquence qui élargit finalement le profil temporel des impulsions³⁹. Ainsi, le GDD introduit par l’objectif du microscope pourrait augmenter la durée des impulsions de la pompe à large bande, la rendant encore plus longue que l’enveloppe temporelle de Stokes et réduisant la bande passante effective et accessible du signal Raman. En outre, cet élargissement pourrait également introduire une distorsion du profil spectral du spectre SRS mesuré.

Dans CARS, le signal spectroscopiquement pertinent émerge à des longueurs d’onde différentes de celles des champs d’excitation. Un simple tube photomultiplicateur ou une caméra CCD (Charge-Coupled Device) peut être utilisé pour intégrer le signal CARS à temps, résumant des milliers d’impulsions pour faire la moyenne du bruit laser. Au lieu de cela, le signal SRS apparaît comme un léger transfert de modulation intégré dans un arrière-plan laser fort et fluctuant. Parce que cette modulation est faible, le bruit laser peut facilement la submerger, réduisant à la fois la vitesse d’imagerie et la sensibilité du microscope SRS. Par conséquent, avant l’imagerie, il est impératif de mesurer le bruit d’intensité relative (RIN) pour déterminer si le laser convient à l’imagerie SRS à grande vitesse et pour sélectionner la fréquence de modulation avec le bruit le plus faible. Le RIN est défini comme la densité spectrale de puissance de bruit [δP(f), avec des unités W²/Hz] du laser normalisée par la puissance optique moyenne ()^40,41. En d’autres termes, le RIN décrit les fluctuations laser normalisées à différentes fréquences (Eq [4]).

(4)

Ainsi, le RIN est un paramètre du système SRS qui détermine la gamme de fréquences de modulation idéale pour les expériences. Par exemple, la barre d’olive de la figure 8 montre la plage de fréquences de modulation idéale pour l’imagerie SRS. Dans le cas du SRS à bande étroite, l’utilisateur doit mesurer le RIN de la pompe et de Stokes pour choisir le faisceau à moduler pour obtenir des performances optimales. Notez de la figure 8, par exemple, que le faisceau de Stokes a un RIN légèrement plus élevé que la pompe, ce qui implique que les mesures SRG s’avéreraient plus bruyantes que leurs homologues SRL. Dans le cas du SRS à large bande, le faisceau à moduler est le faisceau à bande étroite.

La dispersion angulaire D du réseau exprime l’angle de diffraction en fonction de la longueur d’onde et est définie comme la dérivée de l’équation du réseau. Pour la configuration de Littrow, la dispersion angulaire est donnée par Eq (5).

(5)

Pour obtenir Eq (5), nous avons supposé α = β, résolu Eq (2) pour m/d et inséré le résultat dans dβ/ dλ. Notez que dans la configuration de Littrow, β = ^sin-1(mλ/2d). Dans l’approximation à petit angle, le changement de position le long du spectre est fdβ ≈ dl (Figure 10). Ainsi, en insérant dβ dans Eq (5), on peut calculer la dispersion linéaire, une grandeur avec des unités de nm ^mm-1 en utilisant Eq (6) :

(6)

Pour un réseau de diffraction fonctionnant dans la configuration Littrow avec 1 851,85 rainures/mm, d = 540 nm. Si nous utilisons la diffraction de premier ordre de la lumière à ~789 nm, D = 0,0027 rad ^nm-1. Avec un objectif f = 750 mm, nous obtenons une dispersion linéaire de ≈ 0,5 nm ^mm-1, se traduisant par ≈ 7,8 ^cm-1 ^mm-1. Ainsi, la distance focale de la lentille détermine la « densité » de nm par mm au niveau du plan du détecteur : plus la distance focale est longue, moins on obtient de nm par mm, ce qui augmente l’espace entre les raies spectrales de la pompe à large bande. Inversement, avec des distances focales plus courtes, il y aura plus de nm par mm au niveau du plan du détecteur, ce qui réduira l’espace occupé par la pompe dispersée.

La détection équilibrée améliore la qualité d’image et la sensibilité des configurations bruyantes. Par exemple, selon les spectres RIN illustrés à la figure 8 et compte tenu du SRS typique d’une amplitude de 1 x 10-5, le rapport signal/bruit (SNR) déséquilibré est de ≈60. En utilisant une détection équilibrée (c’est-à-dire proche du bruit de tir), il est possible d’atteindre un SNR de ≈145. La figure 11 montre des spectres et des images composites dans des conditions équilibrées et déséquilibrées. Naturellement, les effets de la détection équilibrée ont un impact sur les résultats finaux des expériences, à savoir les cartes chimiques. Forts de ces résultats, nous soulignons que la détection équilibrée est une technique puissante pour contrer les effets néfastes des fluctuations laser sur la qualité de l’image. Il convient de mentionner que la détection équilibrée est la mieux adaptée aux lasers bruyants, tels que les oscillateurs à fibre. Les microscopes SRS fonctionnant avec des sources lumineuses optiques silencieuses (p. ex., les lasers à semi-conducteurs) peuvent ne pas nécessiter une détection équilibrée.

Le protocole explique également une approche basée sur l’optique non linéaire pour trouver le chevauchement spatio-temporel entre les impulsions de ces faisceaux. Nous avons décrit les avantages d’utiliser le 1^ème au lieu du 0^ème ordre de diffraction d’une AOM comme faisceau de Stokes modulé. En outre, les effets néfastes de la dispersion sur l’efficacité de la production de SRS ont été décrits avec des suggestions de moyens de les atténuer via un compresseur à prisme. En outre, le protocole explique comment aligner les prismes et met en évidence trois aspects critiques à prendre en compte pour des performances optimales. Nous discutons non seulement de la pertinence du RIN pour la microscopie SRS, mais nous montrons également comment le mesurer avec un amplificateur à verrouillage et, avec le spectre RIN, définir la meilleure fréquence de modulation. Avec un exemple concret, cet article explique comment l’équation de caillebotis aide à concevoir la chaîne de détection. Enfin, le protocole illustre, avec des données SRS réelles, la structure de l’hypercube SRS et comment l’analyser avec un langage de programmation scientifique classiquement utilisé.

Ce protocole comporte trois limitations mineures. Tout d’abord, le schéma de détection utilisé dans cette contribution consiste en un détecteur de verrouillage multicanal non conventionnel conçu et construit en interne par Sciortino et ^al.26 Comme démontré précédemment²⁵, ce détecteur peut être remplacé par une photodiode équilibrée prête à l’emploi. Bien que cette modification ne concerne que le détecteur et laisse le protocole pratiquement inchangé, avec une photodiode unique, il faut scanner chaque composant spectral du détecteur au lieu de les mesurer tous en même temps. Deuxièmement, ce protocole utilise la détection équilibrée en ligne, ce qui nécessite l’insertion de plusieurs éléments optiques dans le trajet du faisceau. Ces éléments optiques augmentent la complexité du système et entraînent des pertes de puissance optique et un élargissement des impulsions.

La détection équilibrée en ligne exige également que les deux répliques de pompe traversent l’échantillon, une situation qui peut ne pas être idéale pour les échantillons sensibles à la lumière, tels que les cellules vivantes, ou pour les échantillons fortement biréfringents dans lesquels les deux répliques de pompe peuvent présenter des propriétés optiques différentes, annulant ainsi la détection équilibrée. Troisièmement, le protocole repose sur un OPO construit à la maison, un appareil qui peut ne pas être facilement disponible. Cependant, les alternatives aux spectres à large bande délivrés par l’OPO sont le supercontinua des fibres optiques non linéaires ou des cristaux en vrac. Ce dernier ne pouvait être utilisé qu’avec des lasers à faible taux de répétition (jusqu’à 5 MHz). Ainsi, comme pour toute conception expérimentale, le protocole en question présente certaines limites. Cependant, ils sont minimes et ne compromettent pas le succès de cette approche.

Bien qu’un échantillon de référence soit décrit ici, ce protocole peut démêler avec succès des espèces chimiques dans les cellules et les tissus animaux et végétaux, tels que la cellulose, les espèces lipidiques ou les protéines, trouvant des applications pratiques dans différentes quêtes biochimiques ou comme outil de diagnostic en histopathologie. De même, ce protocole peut être un outil précieux en sciences des matériaux. Par exemple, en suivant ce protocole, on peut interroger la composition moléculaire et la concentration des espèces polymères⁴². En outre, cette méthodologie est compatible avec d’autres techniques de microscopie non linéaire, telles que la microscopie à large bande basée sur la sonde pompe⁴³ et les procédés de mélange hétérodyne CARS⁴⁴ à quatre ondes qui, comme avec SRS, nécessitent également deux faisceaux lumineux d’excitation et des mesures de modulation-transfert. Enfin, certaines des informations contenues dans cet article peuvent être appliquées à des techniques d’imagerie non linéaire qui ne reposent pas sur des techniques de transfert de modulation, mais nécessitent l’alignement de deux faisceaux laser pulsés ou plus, tels que les microscopies conventionnelles CARS⁴⁵ et SFG⁴⁶.

En résumé, ce protocole décrit une méthodologie puissante basée sur la microscopie SRS à large bande pour extraire des cartes chimiques et leurs spectres SRS caractéristiques à partir de mélanges chimiquement hétérogènes, fournissant des ensembles de données qui permettent une analyse quantitative simple des données. La polyvalence et la simplicité de la méthode donnent également au lecteur intéressé la possibilité de l’adapter à différentes techniques non linéaires.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D. P. reconnaît le financement du projet CRIMSON de l’Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 101016923 et du projet NEWMED de la région Lombardie au titre de la convention de subvention n° POR FESR 2014-2020. G. C. reconnaît le financement du projet de l’Union européenne GRAPHENE Core3 dans le cadre de la convention de subvention numéro 881603. G. C. reconnaît également le financement de l’Université des sciences et de la technologie du roi Abdallah, numéro de subvention: OSR-2016-CRG5-3017-01.

Materials

Collection objective	Nikon	CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon	Oil immersion objective
Coverslips	Thermo Fisher	043211-KJ	Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Delay line	Physik Instrumente (PI)	M-406.6PD	Precision microtranslation stage, 150 mm travel range
DMSO	Merck	D8418-500ML	Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide
Etalon	SLS Optics Ltd	Custom made	Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring
Excitation objective	Nikon	CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon	Water immersion objective
Grating	LightSmyth	T-1850-800s Series	High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series
Laser	Coherent	Custom made	Fidelity, HP
λ/2	Thorlabs	SAHWP05M-1700	Mounted superachromatic half-wave plate
PBS	Thorlabs	CM5-PBS203/M	16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,
PMMA beads	Merck	MFCD00198073	Micro particles based on polymethacrylate
Prisms	Crisel	320-8218	LASER DISPERSING PRISMS in SF11
PS beads	Merck	72986-10ML-F	Micro particles based on polystyrene
YVO4 crystal	Dr. Sztatecsny GmbH	Custom made	thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 – 1,100 nm

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De la Cadena, A., Vernuccio, F., Talone, B., Bresci, A., Ceconello, C., Das, S., Vanna, R., Cerullo, G., Polli, D. Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63709, doi:10.3791/63709 (2022).