광대역 자극 라만 산란 현미경을 기반으로 한 멀티플렉스 화학 이미징

1. 시료 준비 참고: 이 프로토콜은 화학적으로 이질적인 혼합물의 농도 맵 및 특징적인 SRS 스펙트럼의 검색을 설명합니다. 샘플을 제조하기 위해, 폴리메틸 메타크릴레이트 (PMMA) 마이크로비드의 수성 현탁액으로부터 2 μL를 추출하고( 표 자료 참조) 2 μL 분획을 현미경 커버슬립 상에 부었다. 깨끗한 피펫 팁으로 폴리스티렌(PS) 마이크로비드의 수성 현탁액에서 2μL를 추출하여 커버슬립의 PMMA 현탁액과 결합합니다. 피펫 팁을 사용하여 현탁액을 부드럽게 혼합하고 24 시간 동안 건조시킵니다.참고: 샘플 표면에서 마이크로비드의 양이 불균형하지 않도록 마이크로비드 현탁액의 농도를 신중하게 일치시키는 것이 중요합니다. PS 및 PMMA 비드의 직경은 각각 10 및 6 μm이다. 이러한 치수는 SRS의 생성 효율을 손상시키지 않으면서 현미경의 높은 공간 분해능을 입증할 수 있게 해줍니다. 물이 마르면 나타나는 평평한 흰색 구슬 층 위에 20μL의 디메틸 설폭사이드 (DMSO)를 첨가 한 다음 20μL의 순수한 올리브 오일을 첨가하십시오. 두 번째 현미경 커버 슬립의 가장자리에 매니큐어를 바르십시오. 매니큐어가 아래를 향하도록 하여 혼합물에 커버슬립을 올려 밀봉하기에 충분한 압력을 가합니다. 그것을 말리십시오.참고: 그림 3은 이러한 단계를 통해 얻은 예시적인 결과를 보여줍니다. 제대로 밀봉된 경우, 이 샘플은 최대 석 달까지 지속되어야 합니다. 2. 펌프 및 스토크스 빔 최적화 레이저를 켜고 열적 평형에 도달하게하십시오. 기본 빔에 GDD = -6,000fs2 의 음의 그룹 지연 분산(GDD)을 적용합니다.참고: 이 GDD 값은 OPO를 성공적으로 구동하는 데 중요하며 이 설정에 최적이지만 시스템마다 다를 수 있습니다. 네거티브 GDD는 격자 쌍, 프리즘 압축기, 또는 공간 광 변조기(28)에 기초한 펄스 셰이퍼를 통해 도입될 수 있다. 편광 빔스플리터(PBS1)로 기본 레이저를 두 개의 브랜치로 분할합니다. 협대역 스토크스 펄스를 얻으려면 4W의 한 브랜치를 에탈론으로 안내하십시오. 좁은 스펙트럼 라인이 얻어지고 펄스 스펙트럼의 피크에서 중심이 될 때까지 에탈론을 약간 회전시킨다( 그림 2의 빨간색 곡선 참조).참고 :이 에탈론은 29의 유효 기교와 1,040nm에서 29.8nm의 자유 스펙트럼 범위를 가지고 있습니다. 변조된 스토크스 펄스를 얻으려면 협대역 빔을 acousto -optical 변조기로 보냅니다.참고: 그림 4A에 표시된 것처럼 1차 확산 빔은 100% 변조를 경험하지만 0차 차수는 50%에 불과합니다. 따라서, 임의의 SRS 신호를 발생시키지 않고 샘플 광손상을 유도할 수 있는 강한 변조되지 않은 빔으로 샘플을 비추는 것을 피하기 위해 일차적인 것을 채용하는 것이 바람직하다. 변조 효율을 최적화하려면 렌즈f1 과f2 사이의 거리를 변경하십시오(그림 4B). 광 다이오드로 변조된 빔을 측정하고 오실로스코프로 프로파일을 기록합니다. 오실로스코프 판독값의 진폭과 기준선 사이에서 최대 대비가 달성될 때까지f1 과f2 사이의 거리를 변경하십시오.참고: 이 렌즈 쌍은 시준기로 작동하는 것이 아니라 AOM의 크리스털에 효과적인 초점 스폿을 생성합니다. 세 번째 렌즈 f3 을 배치하여 Stokes 빔의 허리를 미세 조정하여 현미경의 초점면에서의 상호 작용 볼륨을 변경하고 결과적으로 SRS 신호를 최적화하십시오.참고: 스토크스 빔은 이 프로토콜에서 1.6MHz에서 변조되었습니다. 기본 빔의 나머지 6W의 광전력을 리튬 트리보레이트(LBO) 결정(LBO 1, θ = 90°, φ = 13.8°)에 집중하여 초고조파 생성(SHG)을 통해 기본 빔을 주파수-배가시킨다(그림 5A). SHG 효율을 최대화하려면 크리스털을 약간 회전시켜 φ각을 변경합니다(그림 5B). LBO1 을 최적화하여 최소 2.5W의 SHG를 확보하십시오. LBO2 의 φ 각도를 조정하여 신호 빔의 생성 효율을 극대화하십시오.참고: 렌즈 f1, f2 및 f3 의 초점 거리는 SHG 빔과 OPO 캐비티를 모드 일치시키기 위해 신중하게 선택되었습니다. 따라서, 이들 렌즈의 초점 거리는 다른 설정에 따라 달라질 것이다. OPO 캐비티 내의 잔류 분산으로 인해, 캐비티 길이의 약간의 변화는 신호 빔의 스펙트럼의 시프트를 유도한다. 캐비티 길이를 조정하여 1,040nm의 협대역 스토크와 함께 1,373-5,090cm-1 내에서 주파수 디튜닝을 생성할 수 있는 펌프 스펙트럼을 얻으십시오. 이 범위는 CH 스트레칭 스펙트럼 영역 (2,800-3,050 cm-1)의 진동을 포함합니다. 그림 2의 파란색 스펙트럼을 참조하십시오. 여기 현미경 목표에 의해 유도된 분산 효과를 보상하려면 광대역 펌프를 프리즘 압축기로 보냅니다. 펌프를 정점을 통해 프리즘 A에 입력하고 분산 된 펌프를 프리즘 B의 정점 쪽으로 안내하십시오. 필요한 음의 분산량을 정의 한 다음 프리즘의 양봉료 L 사이의 거리를 적절하게 설정하십시오.참고: 도 6은 프리즘(29)의 배열을 도시한다. 이 경우 GDD에 대한 보상은 -12,800fs 2≈ 설정되었습니다. 따라서 L = 1.26 m. 브루스터 컷 프리즘을 사용하십시오. 펌프 빔의 편광이 프리즘의 삼각형 평면(상단/하단 연마되지 않은 면) 내에 있는지 확인하십시오. 펌프빔의 입 사각 θ가 브루스터 각도와 일치하는지 확인하십시오. 프리즘 A의 출구면이 프리즘 B의 입구면과 평행한지 확인하십시오. 보상될 광대역 펄스의 GDD를 추정하기 위해, 단일 파장 λ1에서 SRS 신호를 측정하고, 최대 SRS(λ1)가 획득되는 펌프-스토크들 사이의 시간 지연τ1을 기록한다. 제 2 파장 λ2에 대해 이 절차를 반복하고, SRS(λ2)가 최대였던 시간 지연τ2를 다시 등록한다. 참고: GDD는 각도 주파수에 대한 그룹 지연의 미분으로 정의되기 때문에, 전술한 측정은 광대역 빔의 GDD의 추정을 허용한다(Eq[1]).(1) λ/2 웨이브플레이트를 사용하여 펌프 빔의 편광을 45°로 설정합니다. 편광 펌프를 길이 13.3mm의 YVO4 플레이트로 안내하여 이 복굴절성 결정의 빠른 축을 수직으로 설정합니다.참고: YVO4 플레이트를 통과할 때, 펌프 펄스는 공선으로 전파되는 두 개의 직교 편광 복제본으로 분할되지만 이들 사이에 지연 Δt ≈ 10ps를 유지합니다. 이러한 지연은 복굴절성 결정의 두께 및 굴절률의 함수이다. 이후, Stokes 펄스의 동일한 편광 상태를 갖는 펌프 복제본은 “신호”라고 불리고 직교 상태를 갖는 것은 “참조”로 불릴 것이다. 인라인 균형 잡힌 검출이라고하는이 기술의 세부 사항은 이전에30 번 설명되었습니다. 펌프와 스토크스 빔을 이색성 거울과 결합하고 한 쌍의 형광 핀홀을 사용하여 조심스럽게 정렬하여 둘 다 공선으로 전파되도록하십시오. 빔을 감쇠시키고 렌즈를 사용하여 빠른(최소 100MHz 대역폭) 광 다이오드에 초점을 맞춥니다. 펌프를 차단하고 고대역폭 디지털 오실로스코프로 단일 Stokes 펄스를 측정합니다. 레이저의 트리거 신호를 오실로스코프 측정을 위한 클록 소스로 사용하십시오. 광 다이오드 전압이 최대값에 도달하는 평균값을 결정합니다. 스토크스 빔을 차단하고 펌프 펄스에 대해이 절차를 반복하십시오. 펌프(Stokes) 빔의 펄스가 스토크스(pump) 펄스와 대략 동시에 도착할 때까지 펌프(Stokes) 빔의 광 경로를 늘리거나 줄입니다.참고: 이것은 두 팔 사이의 광학 경로 차이의 일치에서 최대 수 밀리미터의 정밀도를 보장해야 합니다. 광 다이오드를 제거하고 펌프-스토크스 광자 사이의 합 주파수 생성(SFG)에 적합한 절단 각도를 갖는 비선형 크리스털을 배치합니다.참고: 여기에 사용된 비선형 결정은 유형 I 위상 정합, θ = 90°, φ = 9.8°를 위해 절단되었습니다. 비선형 결정의 광축은 스토크스 및 신호 펄스의 편광과 평행해야 합니다. 펌프/스토크스 빔을 약간 비공선형으로 만들고 위상 정합으로 인해 펌프의 SHG와 스토크스 빔 사이에 있는 신호인 SFG가 될 때까지 지연 라인을 이동합니다. 신호가 발견되지 않으면 크리스털에 있는 두 빔의 공간적 중첩을 확인합니다.참고: SFG는 파란색으로 이동하므로 육안으로 쉽게 볼 수 있어야 합니다. 예상치 못한 어려움이 있는 경우 저역 통과 필터를 배치하여 펌프와 스토크스 및 각각의 SHG를 제거하고 분광계로 SFG를 측정합니다(그림 7A). SFG가 최대 강도에 도달하는 시간 지연(비선형 신호 생성에 필요한 이상적인 시공간 중첩을 결정하는 값)을 찾아 지연 선을 고정합니다(그림 7B). 보정된 카메라로 빔 프로파일을 측정합니다. 또는 적외선 카드를 사용하여 눈으로 직경을 추정하십시오. 두 개의 망원경을 사용하는데, 하나는 펌프용이고 다른 하나는 스톡스 빔용입니다. 이러한 망원경을 사용하여 빔 직경을 여기 목표의 뒤쪽 조리개와 일치시킵니다.참고: 이 절차는 설정의 최대 공간 해상도를 보장합니다. SRS 신호가 얻어지면 펌프 빔의 망원경을 사용하여 직경을 조정하고 레일리 범위를 변경하며 결과적으로 현미경 초점에서 상호 작용 부피를 변경하십시오. 최대 SRS가 달성되면 중지하십시오. 광 다이오드를 사용하여 펌프(Stokes) 빔의 강도를 측정하고, 광 다이오드의 응답성으로 검출기의 활성 영역에 충돌하는 평균 전력을 계산합니다. 고대역폭 광 다이오드를 사용하는 경우 전자 저역 통과 필터를 연결하여 상수 또는 DC 구성 요소만 가져옵니다. δP(f)를 측정하려면 고대역폭 광 다이오드의 출력(저역 통과 필터 분리)을 록인 증폭기의 입력에 연결합니다. 잠금 출력을 서로 다른 복조 주파수에 저장하고 광 다이오드의 응답성을 사용하여 V에서 W로 변환합니다.참고: 상용 잠금 증폭기에는 δP(f)를 측정하기 위한 도구가 내장되어 있습니다(예: LabOne에 주파수 스위퍼(31)에 통합된 취리히 인스트루먼트). 빔의 RIN을 측정한 후, 레이저를 끄고 전자 잡음(즉, 검출기에 어떠한 빛도 없이 계산된 RIN을 측정한다)을 측정한다.참고: RIN이 샷 노이즈가 아닌 레이저 변동에 의해 제한되는 경우, 이 어두운 측정은 측정에 사용되는 계측기를 진단하는 데 도움이 됩니다. 전자 잡음이 레이저의 RIN만큼 높으면 레이저의 RIN을 측정하는 데 사용할 수 없습니다. 초저잡음 증폭기는 전자 잡음을 줄이기 위해 사용되어야 할 수 있다. RIN이 레이저 변동이 아닌 샷 노이즈에 의해 제한되는 경우, 검출기에 더 많은 광학적 전력을 비추십시오. 그림 8을 참조하십시오. 3. SRS 이미징을 위한 스펙트럼 검출 설정 펌프와 스토크스 빔을 현미경으로 안내하십시오. 섹션 1에서 논의된 샘플을 배치하고, 펌프 빔을 정렬하는 데 도움이 되는 비드가 없는 영역을 찾으십시오. 카메라를 사용하여 펌프(Stokes)를 차단하면서 스토크스(펌프) 빔의 반사 프로파일을 측정합니다. 현미경 바로 전에 거울로 레이저 반점의 위치를 조정하십시오.참고: 가장 높은 SRS 생성을 얻으려면 SRS 생성이 완벽하게 겹쳐야 합니다. 그림 9는 (A) 펌프, (B) 스토크스, 및 (C) 두 빔이 현미경의 초점면에서 완벽하게 겹쳐진 것을 보여준다. 흥분 및 수집 목표를 공초점으로 만드십시오.참고: 무한대 보정 목표를 사용하면 펌프를 샘플 평면에 집중하면 수집 대상의 뒤쪽 조리개에서 시준된 빔이 생성됩니다. 단거리 통과 필터를 넣어 변조 된 스토크를 제거하고 펌프 빔을 격자로 안내하십시오. 격자 뒤에 렌즈를 놓아 분산된 빔을 검출기에 초점을 맞춥니다.참고: 격자 방정식은 선형 분산(즉, 주어진 초점 거리 f32의 렌즈를 갖는 검출기 평면에서 mm당 얼마나 많은 nm)을 결정하는 데 도움이 될 것이다. 격자 방정식은 격자의 홈 주기성 d, 입사각 α, 회절각β, 회절파장 λ, 및 회절차수 m(Eq[2])에 관한 것이다. (2) 균형 잡힌 감지를 위해 기준의 스펙트럼과 펌프 빔을 따라 전파되는 신호 복제본을 측정하십시오.참고: 격자 이후의 펌프 빔의 공간 프로파일은 길이에 따라 광대역 펌프의 다른 스펙트럼 성분을 포함하는 라인입니다. 펌프 라인의 각 스펙트럼 성분은 구형 렌즈에 의해 거리 f 에 초점을 맞출 것이다(단계 3.1-3.2 참조). 분산된 펌프를 클리핑하지 않으려면 구형 렌즈를 격자에 최대한 가깝게 두십시오. 구형 렌즈 바로 뒤에 PBS를 넣어 펌프 복제본을 분리한다.참고 : 여기서 편광 큐브 빔 스플리터는 이러한 종류의 편광자가 펌프 빔의 편광을 스크램블하지 않기 때문에 사용되었습니다. 또한 서로 다른 펌프 복제본을 효과적으로 분리하고 광대역 펌프 클리핑을 피할 수 있을 만큼 충분히 클 수 있습니다. PBS는 신호 레플리카(s-polarized)를 반사하고 기준 레플리카(p-polarized)를 전송할 것이다. 한 쌍의 스티어링 미러를 사용하여 신호를 안내하고 해당 감지기를 참조합니다(그림 1).참고: 이상적인 균형 잡힌 구성에서 신호 및 참조 복제본은 동일한 광 전력을 가져야 합니다. 펌프 빔에서 잡음을 제거하려면 신호를 측정하는 광 다이오드 어레이의 채널을 기준 검출기의 해당 채널과 상관 관계를 지정합니다. 따라서 신호 및 기준 광 다이오드 어레이의 n번째 광 다이오드가 신호 및 기준 복제본의 동일한 스펙트럼 구성 요소의 광 전력을 측정하는지 확인하십시오.참고: 도 8은 예시적인 RIN 스펙트럼을 도시한다. 두 광 다이오드 어레이 간의 스펙트럼 정합을 보장하려면 격자와 PBS 사이에 작은 슬릿 또는 아이리스를 배치하여 분산된 펌프를 공간적으로 필터링합니다. 펌프 복제본의 하나의 스펙트럼 구성 요소를 제외한 모든 스펙트럼 구성 요소를 클립하여 전송 된 광선을 참조 및 신호 광 다이오드 어레이의 n번째 검출기에 집중시킵니다. 언급 된 스티어링 미러를 사용하여 다른 감지 채널의 상관 관계를 조정하십시오. 이 시점에서 SRS 현미경을 시작하십시오. 이를 위해 스톡스를 변조하고, 래스터-스캔 샘플을 스캔하고, 펌프 스펙트럼(ΔI)에서 해당 DC 스펙트럼(I)으로 변조 전송을 획득하여 각 픽셀로부터 정규화된 SRS(ΔI/I) 스펙트럼을 얻는다. 행(x)과 열(y)에 샘플의 스캔된 위치가 포함된 입체 행렬을 생성합니다. xy 평면에 직교하는 각 벡터(z) 상에 SRS 스펙트럼을 저장한다.참고: 도 12는 SRS 하이퍼스펙트럼 데이터의 구조를 보여준다. 스토크스 빔의 전력을 65mW로, 광대역 펌프 빔의 전력을 20mW로 설정합니다. 실험에 이상적인 통합 시간을 설정합니다.참고: 여기서, 통합 시간은 44 μs; 그러나, 픽셀 체류 시간은 느린 압전 스캐너 때문에 1ms였다. 4. 하이퍼스펙트럼 SRS 데이터의 화학측정 다변량 곡선 분해능 분석을 사용하여 샘플의 다양한 화학 성분을 분리합니다. Tauler, de Juan 및 Jaumot33의 링크에서 GUI를 다운로드하십시오.참고: 여기에서는 Tauler와 동료가 개발한 다변량 곡선 해상도-교대 최소 제곱(MCR-ALS) MATLAB 프로그램이34,35개를 사용했습니다. SRS 데이터에 대한 MCR-ALS의 적용에 대해서는 36,37을 참조하십시오. 알고리즘에 대한 자세한 논의는 38을 참조하십시오. MATLAB에서 SRS 하이퍼스펙트럼 데이터 큐브를 SRS 스펙트럼을 포함하는 행이 있는 행렬 D로 재구성합니다. 펼쳐진 SRL 하이퍼큐브 D가 샘플의 화학적 구성성분의 농도 C와 스펙트럼 프로파일 S의 선형 조합이라고 가정한다(즉, D= CS T+ E, 여기서 E는 실험 오차를 포함하는 매트릭스이고, 위 첨자 T는 매트릭스 전치를 나타낸다). C와 S를 분리하기 위해 데이터의 주요 구성 요소를 얻습니다. 섹션 1에서 논의 된 샘플에는 DMSO, 올리브 오일, PMMA 및 PS의 네 가지 종, 즉 네 종과 배경 소음을 설명하기 위해 다른 종을 검색하도록 프로그램을 구성한다는 것이 선험적으로 알려져 있습니다. 종 수가 많거나 적은 다른 표본이 있는 경우 그에 따라 프로그램을 구성하십시오.참고 : 프로그램은 스펙트럼 데이터의 단수 값 분해를 수행하여 순수 스펙트럼 S의 초기 추측으로 사용합니다. 대안적으로, 알려진 스펙트럼 트레이스(예를 들어, 물질의 자발적인 라만 스펙트럼)를 포함하는 매트릭스로 프로그램을 공급한다.참고 : 순수 스펙트럼의 초기 추정치를 사용하여 프로그램은 C = DS (S T S) – 1 및 S T = (C T C) – 1 C T D를 계산합니다. C와 S의 새로운 값은 교대로 최소 제곱 알고리즘으로 최적화됩니다. SRS는 음수가 아닌 신호이므로 교대로 최소 제곱 알고리즘을 제한하여 양수 값만 전달하도록 합니다.참고: 최적화된 C와 S를 사용하면 프로그램이 원래 데이터 D와 비교할 데이터 세트인 새 행렬 D*= CST를 구성할 수 있습니다. 프로그램은 D*와 D의 차이가 정의될 수 있는 임의의 임계값보다 작을 때까지 이러한 단계를 자동으로 반복합니다. C 및 S를 플롯하여 샘플의 화학적 구성성분의 화학적 이미지 및 특징적인 스펙트럼을 획득한다.