Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy

Alejandro De la Cadena; Federico Vernuccio; Benedetta Talone; Arianna Bresci; Chiara Ceconello; Subir Das; Renzo Vanna; Giulio Cerullo; Dario Polli

doi:10.3791/63709

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Engenharia

Chemische Multiplex-Bildgebung auf Basis einer breitbandstimulierten Raman-Streumikroskopie

Published: July 25, 2022

doi:

10.3791/63709

Alejandro De la Cadena¹, Federico Vernuccio¹, Benedetta Talone¹, Arianna Bresci¹, Chiara Ceconello¹, Subir Das¹, Renzo Vanna², Giulio Cerullo^1,2, Dario Polli^1,2

¹Dipartimento di Fisica,Politecnico di Milano, ²Institute for Photonics and Nanotechnologies (IFN-CNR)

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll zur Aufnahme chemischer Bilder mit breitbandig stimulierter Raman-Streuung (SRS) -Mikroskopie. Basierend auf einem SRS-Mikroskop, das mit differentieller Mehrkanal-Lock-in-Detektion arbeitet, beschreibt das Protokoll die Probenvorbereitung, die Anpassung der SRS-Vorrichtung und die Chemometrie, um verschiedene Bestandteile chemisch heterogener Proben zu entwirren.

Abstract

Die stimulierte Raman-Streuung (SRS) ist eine nichtlineare optische Technik zur markierungsfreien chemischen Bildgebung. Dieses Analysewerkzeug liefert chemische Karten mit hoher Geschwindigkeit und hoher räumlicher Auflösung dünner Proben, indem es ihre molekularen Schwingungen direkt abfragt. In ihrer Standardimplementierung ist die SRS-Mikroskopie schmalbandig und bildet Bilder mit jeweils nur einer einzigen Schwingungsfrequenz. Dieser Ansatz behindert jedoch nicht nur die chemische Spezifität von SRS, sondern vernachlässigt auch die Fülle an Informationen, die in Schwingungsspektren kodiert sind.

Diese Einschränkungen können durch Breitband-SRS überwunden werden, eine Implementierung, die in der Lage ist, ein Schwingungsspektrum pro Pixel des Bildes parallel zu extrahieren. Dies liefert hyperspektrale Daten, die in Verbindung mit einer chemometrischen Analyse die Menge der von der Probe abgerufenen Informationen maximieren. Somit verbessert Breitband-SRS die chemische Spezifität des Systems und ermöglicht die quantitative Bestimmung der Konzentration der verschiedenen Bestandteile einer Probe. Hier berichten wir über ein Protokoll für die chemische Bildgebung mit breitbandiger SRS-Mikroskopie, basierend auf einem selbstgebauten SRS-Mikroskop, das mit einer benutzerdefinierten differentiellen Mehrkanal-Lock-in-Verstärkererkennung arbeitet. Es diskutiert die Probenvorbereitung, die Ausrichtung der SRS-Vorrichtung und die chemometrische Analyse. Durch die Erfassung von Schwingungs-Raman-Spektren veranschaulicht das Protokoll, wie verschiedene chemische Spezies innerhalb eines Gemisches identifiziert und ihre relativen Konzentrationen bestimmt werden können.

Introduction

Die Raman-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Bildgebungstechnik, die durch die Messung der Raman-Streuung¹, eines inelastischen Strahlungsprozesses, der von Molekülen ausgeht, die als Reaktion auf einfallendes Licht vibrieren ^2,3, reichhaltige chemische Karten liefert. Jedes Pixel einer Raman-Karte enthält ein Spektrum, das direkte Informationen über die chemische Zusammensetzung und Struktur der Probe enthält, was zu Bildern mit intrinsischem Schwingungskontrast führt. Bis heute ist die Raman-Mikroskopie der Referenzpunkt für die Untersuchung molekularer Schwingungen durch Mikrospektroskopie, da kein anderes bildgebendes Verfahren Bilder mit hoher chemischer Spezifität und hoher räumlicher Auflösung^{erzeugen kann 4}. Trotz seiner herausragenden chemischen Spezifität ist die Erzeugungseffizienz der Raman-Streuung gering, was entweder verlängerte Pixelverweilzeiten oder eine starke Anregung erfordert, was zu niedrigen Aufnahmeraten und Inkompatibilität mit empfindlichen Proben führt.

Dieser einzelne Mangel der Raman-Mikroskopie veranlasste die Forscher, die ^kohärente Raman-Streuung ^5,6,7,8,9 als Kontrastquelle für die Mikroskopie anzuwenden. Dies ist ein nichtlinearer optischer Prozess, der die Schwingungsreaktion um mehrere (bis zu sieben) Größenordnungen erhöht und so eine chemische Hochgeschwindigkeitsbildgebung^10,11,12,13 ermöglicht. Insbesondere sind die beiden am häufigsten verwendeten kohärenten Raman-Streutechniken die kohärente Anti-Stokes-Raman-Streuung (CARS)¹⁴ und die stimulierte Raman-Streuung (SRS)¹⁵. Im Gegensatz zu CARS zeigt SRS eine lineare Abhängigkeit von der Konzentration resonanter Moleküle. Es ist immun gegen den nicht-resonanten Hintergrund, einen nichtlinearen Effekt, der nichts mit einem Schwingungsübergang zu tun hat, aber die Lorentzschen Formen verzerrt, die für die Raman-Spektren der molekularen Schwingungen charakteristisch sind^16,17. So liefert die SRS-Mikroskopie authentische Raman-Informationen, die eine direkte quantitative Bildanalyse ermöglichen.

SRS ist ein nichtlineares, optisches Verfahren dritter Ordnung, das direkte Informationen über die chemischen Bindungen einer Probe liefert. Sie entsteht durch die raumzeitliche Überlagerung zweier optischer Felder, die im Allgemeinen im nahinfraroten Spektralbereich liegen, nämlich der Pumpe und der Stokes bei der Frequenz ω_pu bzw. ω_S ^10,11,18. Diese Überlagerung erzeugt einen Schlag bei der Pump-Stokes-Frequenzverstimmung Ω = ω_pu-ω _S. Wenn Ω mit einer molekularen Schwingung Ω_R übereinstimmt, schwingt das Molekül mit und verursacht einen kohärenten Energietransfer zwischen den Lichtfeldern und dem Molekül. Dadurch erreicht das Molekül einen schwingungsangeregten Zustand. Dieser Prozess kann überwacht werden, indem entweder die Vernichtung von Pumpphotonen (ein Signal, das als stimulierter Raman-Verlust [SRL] bekannt ist) oder die gleichzeitige Verstärkung von Stokes-Photonen (ein Prozess, der als stimulierter Raman-Gewinn [SRG] bekannt ist) gemessen wird. SRG und SRL sind kleine Signale (ΔI), die auf einem intensiven und schwankenden Hintergrund (I) sitzen. Da typische Werte des SRS-Signals (ΔI/I) im Bereich von ^10-6-10-4 liegen, kann das Laserrauschen es leicht verdecken. Um die schädlichen Auswirkungen des Laserrauschens auf das Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) und damit auf die Bildgebungsgeschwindigkeit zu mildern, stützt sich die SRS-Detektion auf Modulationsübertragungstechniken (z. B. Lock-in-Verstärker, Resonanzschaltungen oder Box-Car-Averager) bei hohen Modulationsfrequenzen (>1 MHz), wobei das Laserrauschen seine Mindestwerte^15,19,20 erreicht.

Die konventionelle SRS-Mikroskopie verwendet schmalbandige (≈10 cm−1) Pumpe und Stokes-Impulse, um chemische Bilder mit einer einzigen Schwingungsfrequenz zu erzeugen, was eine Videofrequenz-Bildgebung mit Pixelverweilzeiten von nur ≈100 ns^21,22 ermöglicht. Da die schmalbandige SRS-Mikroskopie jedoch chemische Karten bildet, indem sie die Probe sequentiell bei nur wenigen Schwingungsfrequenzen abtastet, ist ihre Information begrenzt²³. SRS-Bilder mit einem oder zwei Schwingungskontrasten reichen möglicherweise nicht aus, um chemische Spezies mit überlappenden Raman-Bändern zu unterscheiden, insbesondere innerhalb heterogener Systeme. Daher schöpft das paradigmatische schmalbandige SRS-Mikroskop nicht das volle Potenzial von SRS aus, da die Untersuchung einer Handvoll Schwingungsfrequenzen seine chemische Spezifität behindert und die Fülle an Informationen vernachlässigt, die in Schwingungsspektren kodiert sind. Darüber hinaus führt das sequentielle Scannen der Probe bei verschiedenen Frequenzen zu verlängerten Pixelverweilzeiten, die Lichtschäden auslösen und eine strenge räumliche Koregistrierung zwischen aufeinanderfolgenden Bildern verhindern können, was zu Bewegungsartefakten führt.

Im Gegensatz zu ihrem schmalbandigen Gegenstück erhält die breitbandige SRS-Mikroskopie bei jedem Sample-Scan^10,12,24 ein Schwingungsspektrum pro Pixel. Somit bietet Breitband-SRS hyperspektrale Bildgebung mit strenger räumlicher Koregistrierung verschiedener Schwingungskontraste, was eine rigorose Datenanalyse ermöglicht. Dies zeigt nicht nur die chemischen Bestandteile der Probe durch Raman-Spektren auf, sondern hilft auch, ihre relativen Konzentrationen zu bestimmen. Je nachdem, wie die Spektren aufgenommen werden, wird die breitbandige SRS-Mikroskopie entweder als hyperspektrales SRS oder Multiplex-SRS klassifiziert. Beim hyperspektralen SRS wird das SRS-Spektrum pro gescanntem Punkt der Probe sequentiell erfasst (d. h. es wird durch Sweeping der Frequenzverstimmung Ω) abgerufen und ein SRS-Spektrum gebildet, indem die SRS-Signale bei aufeinanderfolgenden Raman-Verschiebungen zusammengestapelt werden. Das Raman-Spektrum wird gleichzeitig in mehreren Schwingungsmodi im Multiplex-SRS gemessen. So kombiniert der Multiplex-SRS-Ansatz einen modulierten Schmalbandpuls mit einem Breitbandpuls, um das SRS-Signal bei verschiedenen Frequenzen anzutreiben, und verwendet einen Mehrkanaldetektor mit einer Empfindlichkeit, die mit der von Schmalband-SRS vergleichbar ist, um die SRS-Spektren zu detektieren.

Dieses Papier stellt ein Protokoll zur Erstellung chemischer Karten heterogener Proben unter Verwendung der Multiplex-SRS-Mikroskopie vor. Ein Schema des in diesem Protokoll verwendeten SRS-Mikroskops ist in Abbildung 1 dargestellt und an anderer Stelle^{ausführlich beschrieben 25,26,27}. Kurz gesagt, ein kommerzieller modusgebundener Yb-Faserlaser, der 140 fs-Pulse mit einer Mitte von 1040 nm mit einer durchschnittlichen Leistung von 10 W und einer Wiederholungsrate von 80 MHz erzeugt, treibt das Breitband-SRS-Mikroskop an. Ein polarisierender Strahlteiler (PBS) trennt den Grundstrahl in zwei Zweige. Um die schmalbandigen Stokes-Impulse zu erzeugen, wird ein Zweig mit 4 W des Grundstrahls an ein Etalon gesendet, das einen schmalbandigen (≈15 ^cm-1) Strahl erzeugt, der dann bei 1,6 MHz mit einem akustischen optischen Modulator (AOM) moduliert wird. Der verbleibende Anteil mit 6 W des Grundstrahls ist frequenzverdoppelt mit einem 2,8 mm dicken Lithiumtriborat (LBO)-Kristall, geschnitten für Typ-I-Phasenanpassung (θ = 90°, φ = 13,8°). Die resultierende zweite harmonische Erzeugung bei 520 nm wandert zu einem X-gefalteten Hohlraum, um einen optischen parametrischen Oszillator (OPO) zu pumpen, ein Gerät, das einen 3,0 mm dicken LBO-Kristall (Typ-I-Phasenanpassung, θ = 90 °, φ = 9,8 °) als aktives Medium verwendet, um eine breitbandige optische Strahlung zu liefern, die innerhalb des 680-910 nm-Spektralbereichs abstimmbar ist (Abbildung 2). Diese Breitbandimpulse dienen als Pumpe in den SRS-Experimenten und verteilen sich auf einen Prismenkompressor, um die durch das mikroskopische Objektiv induzierten Dispersionseffekte vorzukompensieren.

Nach der Kompressionsstufe erzeugt eine λ/2-Wellenplatte in Kombination mit einer doppelbrechenden YVO_4-Platte zwei orthogonal polarisierte Nachbildungen, deren elektronische Subtraktion an der Detektionsebene das Rauschen der Breitbandpumpe aufhebt. Ein dichroitischer Spiegel kombiniert die Pumpe und die Stokes-Strahlen und sendet sie an ein aufrechtes Mikroskop. Ein Wassertauchobjektiv mit einer numerischen Apertur (NA) von 1,27 fokussiert das Licht auf die Probe, während ein Öl-Tauchobjektiv mit einem NA von 1,4 es sammelt. Vor der Detektionsphase entfernt ein Kurzpassfilter (SPF) die modulierten Stokes, während ein Beugungsgitter, das in der Littrow-Konfiguration arbeitet, die übertragene Breitbandpumpe verteilt. Eine zweite PBS₂ trennt die Nachbildungen der Pumpe, und eine Linse fokussiert sie auf zwei Fotodiodenarrays. Die Signale dieser Photodiodenarrays werden elektronisch subtrahiert und an einen selbstgebauten Mehrkanal-Lock-in-Verstärker (M-LIA) gesendet. Das demodulierte Signal wird dann durch die Gleichstrommesswerte (DC) eines der Photodiodenarrays normalisiert, wodurch das SRL-Spektrum erzeugt wird.

Als beispielhaftes Experiment stellen wir Mischungen aus mehreren bekannten Raman-Streuern mit jeweils einem einzigartigen Raman-Spektrum dar. Daher beginnt das Protokoll mit der Beschreibung, wie die Referenzproben vorbereitet werden. Während wir SRL erkennen, erklären wir weiterhin, wie man schmalbandige Stokes-Impulse erhält und die optische Quelle einrichtet, die die breitbandigen (≈250 ^cm-1) Pumpimpulse liefert, nämlich den selbstgebauten OPO. Das Protokoll zeigt die Ausrichtung und Optimierung der optischen Strahlen und beschreibt kritische Parameter wie die Leistung und Spektren des schmalbandigen Stokes und der Breitbandpumpe. Das Protokoll beschreibt detailliert den optischen Pfad der Breitbandpumpe, da er spezielle optische Elemente benötigt. Es erklärt auch, wie man die raumzeitliche Überlappung zwischen Pump-Stokes-Impulsen findet und zeigt einen praktischen Weg, um das relative Intensitätsrauschen (RIN) zu bestimmen, was wiederum dazu beiträgt, die beste Modulationsfrequenz für SRS-Experimente zu definieren. Dann erklären wir das Funktionsprinzip und die Kalibrierung der Detektionskette. Schließlich zeigt das Protokoll den Datenerfassungsprozess, die Chemometrie und die Bildverarbeitungspipeline.

Protocol

1. Probenvorbereitung HINWEIS: Dieses Protokoll beschreibt das Abrufen der Konzentrationskarten und charakteristischen SRS-Spektren chemisch heterogener Gemische. Um die Probe vorzubereiten, extrahieren Sie 2 μL aus einer wässrigen Suspension von Polymethylmethacrylat (PMMA) Mikrokügelchen (siehe Materialtabelle) und gießen Sie die 2 μL-Fraktion auf ein Mikroskop-Deckglas. Mit einer sauberen Pipettenspitze 2 μL aus einer wässrigen Suspension aus Polystyrol (PS) -Mikroperlen extrahieren und mit der PMMA-Suspension auf dem Deckglas kombinieren. Mit einer Pipettenspitze die Suspension vorsichtig vermischen und 24 h trocknen lassen.HINWEIS: Es ist wichtig, die Konzentration der Mikroperlensuspensionen sorgfältig anzupassen, um unverhältnismäßige Mengen der Mikrokügelchen auf der Probenoberfläche zu vermeiden. Der Durchmesser der PS- und PMMA-Perlen beträgt 10 bzw. 6 μm. Diese Abmessungen ermöglichen es, die hohe räumliche Auflösung des Mikroskops zu demonstrieren, ohne die Erzeugungseffizienz von SRS zu beeinträchtigen. Auf der flachen, weißen Perlenschicht, die erscheint, wenn das Wasser abtrocknet, fügen Sie 20 μL Dimethylsulfoxid (DMSO) und dann 20 μL reines Olivenöl hinzu. Tragen Sie Nagellack auf die Ränder eines zweiten Mikroskopdeckglases auf. Legen Sie das Deckglas mit dem Nagellack nach unten auf die Mischung und üben Sie genügend Druck aus, um es zu versiegeln. Lassen Sie es trocknen.HINWEIS: Abbildung 3 zeigt beispielhafte Ergebnisse, die mit diesen Schritten erzielt wurden. Bei ordnungsgemäßer Versiegelung sollte diese Probe bis zu drei Monate halten. 2. Optimierung von Pumpe und Stokes-Trägern Schalten Sie den Laser ein und lassen Sie ihn das thermische Gleichgewicht erreichen. Wenden Sie eine negative Gruppenverzögerungsdispersion (GDD) von GDD = -6.000 fs2 auf den Fundamentalstrahl an.HINWEIS: Dieser GDD-Wert ist entscheidend für den erfolgreichen Betrieb des OPO und für dieses Setup optimal, variiert jedoch wahrscheinlich in verschiedenen Systemen. Negative GDD kann durch Gitterpaare, Prismenkompressoren oder Pulsformer auf Basis räumlicher Lichtmodulatoren28 eingeleitet werden. Teilen Sie den Fundamentallaser mit einem polarisierenden Strahlteiler (PBS1) in zwei Zweige auf. Um die schmalbandigen Stokes-Impulse zu erhalten, führen Sie einen Zweig mit 4 W zu einem Etalon. Drehen Sie das Etalon leicht, bis eine schmale Spektrallinie erhalten und auf dem Höhepunkt des Pulsspektrums zentriert ist (siehe die rote Kurve in Abbildung 2).HINWEIS: Dieses Etalon hat eine effektive Finesse von 29 und einen freien Spektralbereich von 29,8 nm bei 1.040 nm. Um modulierte Stokes-Impulse zu erhalten, senden Sie den schmalbandigen Strahl an einen akusto-optischen Modulator.HINWEIS: Wie in Abbildung 4A gezeigt, erfährt der gebeugte Strahl erster Ordnung eine Modulation von 100 %, während der Strahl nullter Ordnung nur 50 % beträgt. Daher ist es vorzuziehen, die erste Ordnung zu verwenden, um zu vermeiden, dass die Probe mit einem starken, unmodulierten Strahl beleuchtet wird, der Probenfotoschäden verursachen kann, ohne ein SRS-Signal zu erzeugen. Um die Modulationseffizienz zu optimieren, ändern Sie den Abstand zwischen den Linsen f1 und f2 (Abbildung 4B). Messen Sie den modulierten Strahl mit einer Fotodiode und zeichnen Sie sein Profil mit einem Oszilloskop auf. Ändern Sie den Abstand zwischen f1 und f2, bis der maximale Kontrast zwischen der Amplitude und der Basislinie der Oszilloskopwerte erreicht ist.HINWEIS: Dieses Paar Linsen fungiert nicht als Kollimator, sondern erzeugt einen effektiven Brennpunkt am Kristall des AOM. Platzieren Sie eine dritte Linse f 3, um die Taille des Stokes-Strahls zu verfeinern, so dass das Interaktionsvolumen in der Brennebene des Mikroskops geändert und folglich das SRS-Signal optimiert werden kann.HINWEIS: Der Stokes-Strahl wurde in diesem Protokoll bei 1,6 MHz moduliert. Fokussieren Sie die verbleibenden 6 W der optischen Leistung des Grundstrahls auf einen Lithiumtriborat (LBO)-Kristall (LBO 1, θ = 90°, φ =13,8 °), um den Grundstrahl durch zweite harmonische Erzeugung (SHG) frequenzverdoppelnd (Abbildung 5A). Um die SHG-Effizienz zu maximieren, drehen Sie den Kristall leicht und variieren Sie den φ Winkel (Abbildung 5B). Optimieren Sie LBO 1, um mindestens2,5 W SHG zu erhalten. Passen Sie den φ Winkel von LBO2 an, um die Erzeugungseffizienz des Signalstrahls zu maximieren.HINWEIS: Die Brennweiten der Objektive f1, f2 und f 3 wurden sorgfältig ausgewählt, um den SHG-Strahl an den OPO-Hohlraum anzupassen. Daher variieren die Brennweiten dieser Objektive in verschiedenen Setups. Aufgrund der Restdispersion im OPO-Resonator induziert eine leichte Änderung der Kavitätenlänge eine Verschiebung des Spektrums des Signalstrahls. Stellen Sie die Kavitätenlänge ein, um ein Pumpenspektrum zu erhalten, das zusammen mit dem schmalbandigen Stokes bei 1.040 nm eine Frequenzverstimmung innerhalb von 1.373-5.090 cm-1 erzeugen kann. Dieser Bereich deckt die Schwingungen im CH-Streckspektralbereich (2.800-3.050 cm-1) ab. Siehe die blauen Spektren in Abbildung 2. Um die durch das Anregungsmikroskopobjektiv induzierten Dispersionseffekte zu kompensieren, schicken Sie die Breitbandpumpe zu einem Prismenkompressor. Geben Sie die Pumpe durch ihren Scheitelpunkt in Prisma A ein und führen Sie die dispergierte Pumpe zum Scheitelpunkt von Prisma B. Definieren Sie die Menge der erforderlichen negativen Dispersion und stellen Sie dann den Abstand zwischen den Spitzen der Prismen L entsprechend ein.HINWEIS: Abbildung 6 zeigt die Anordnung der Prismen29. In diesem Fall wurde die Entschädigung für GDD ≈ -12.800 fs2 festgelegt; daher L = 1,26 m. Verwenden Sie Brewster-geschnittene Prismen. Stellen Sie sicher, dass die Polarisation des Pumpenstrahls innerhalb der dreieckigen Ebenen der Prismen liegt (obere/untere unpolierte Flächen). Stellen Sie sicher, dass der Einfallswinkel θin des Pumpenstrahls mit dem Brewster-Winkel übereinstimmt. Stellen Sie sicher, dass die Ausgangsfläche von Prisma A parallel zur Eingangsfläche von Prisma B verläuft. Um die GDD des zu kompensierenden Breitbandimpulses zu schätzen, messen Sie das SRS-Signal bei einer einzigen Wellenlänge λ 1 und zeichnen Sie die Zeitverzögerungτ 1 zwischen Pump-Stokes auf, bei der das maximale SRS(λ 1) erhalten wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang für eine zweite Wellenlänge λ 2 und registrieren Sie erneut die Zeitverzögerung τ 2, bei der die SRS(λ2) maximal war.HINWEIS: Da die GDD als Ableitung der Gruppenverzögerung in Bezug auf die Winkelfrequenz definiert ist, erlauben die oben genannten Messungen die Abschätzung der GDD des Breitbandstrahls (Eq [1]).(1) Stellen Sie die Polarisation des Pumpstrahls mit einer λ/2-Wellenplatte auf 45° ein. Führen Sie die polarisierte Pumpe auf eine YVO4-Platte mit einer Länge von 13,3 mm und stellen Sie die schnelle Achse dieses doppelbrechenden Kristalls vertikal ein.HINWEIS: Auf dem Weg durch die YVO4-Platte werden die Pumpenimpulse in zwei orthogonal polarisierte Repliken aufgeteilt, die sich kolminant ausbreiten, aber eine Verzögerung von Δt ≈ 10 ps zwischen ihnen halten. Diese Verzögerung ist eine Funktion der Dicke und der Brechungsindizes des doppelbrechenden Kristalls. Im Folgenden werden die Pumpenrepliken mit dem gleichen Polarisationszustand der Stokes-Impulse als “Signal” bezeichnet, während solche mit einem orthogonalen Zustand als “Referenz” bezeichnet werden. Die Details dieser Technik, die als Inline-Balanced-Erkennung bezeichnet wird, wurden zuvorbeschrieben 30. Kombinieren Sie die Pumpe und die Stokes-Strahlen mit einem dichroitischen Spiegel und richten Sie sie vorsichtig mit einem Paar fluoreszierender Pinholes aus, um sicherzustellen, dass sich beide kollinear ausbreiten. Dämpfen Sie die Strahlen und fokussieren Sie sie mit einem Objektiv auf eine schnelle Photodiode (mindestens 100 MHz Bandbreite). Blockieren Sie die Pumpe und messen Sie einzelne Stokes-Impulse mit einem digitalen Oszilloskop mit hoher Bandbreite. Verwenden Sie das Triggersignal des Lasers als Uhrenquelle für die Messungen des Oszilloskops. Bestimmen Sie den Mittelwert, bei dem die Photodiodenspannung ihr Maximum erreicht. Blockieren Sie den Stokes-Strahl und wiederholen Sie diesen Vorgang für die Pumpenimpulse. Erhöhen oder verringern Sie den optischen Pfad des Pumpstrahls (Stokes), bis seine Impulse ungefähr zur gleichen Zeit wie die Stokes (Pump) -Impulse ankommen.HINWEIS: Dies sollte eine maximale Genauigkeit von wenigen Millimetern bei der Abstimmung der optischen Wegdifferenz zwischen den beiden Armen gewährleisten. Entfernen Sie die Photodiode und platzieren Sie einen nichtlinearen Kristall mit einem geeigneten Schnittwinkel für die Summenfrequenzerzeugung (SFG) zwischen Pump-Stokes-Photonen.HINWEIS: Der hier verwendete nichtlineare Kristall wurde für die Typ-I-Phasenanpassung geschnitten, θ = 90°, φ = 9,8°. Die optische Achse des nichtlinearen Kristalls sollte parallel zur Polarisation der Stokes und Signalimpulse verlaufen. Machen Sie die Pump-/Stokes-Strahlen leicht nichtkollinear und verschieben Sie die Verzögerungsleitung bis zum SFG, einem Signal, das sich aufgrund der Phasenanpassung zwischen den SHGs der Pumpe und den Stokes-Strahlen befindet. Wenn das Signal nicht gefunden wird, überprüfen Sie die räumliche Überlappung der beiden Strahlen auf dem Kristall.HINWEIS: Der SFG ist blauverschoben und sollte mit bloßem Auge gut sichtbar sein. Bei unerwarteten Schwierigkeiten setzen Sie einen Tiefpassfilter ein, um die Pumpe und Stokes und ihre jeweiligen SHGs zu entfernen, und messen Sie die SFG mit einem Spektrometer (Abbildung 7A). Finden Sie die Zeitverzögerung, mit der der SFG seine maximale Intensität erreicht, einen Wert, der die ideale raumzeitliche Überlappung bestimmt, die für die nichtlineare Signalerzeugung erforderlich ist, und fixieren Sie dort die Verzögerungslinie (Abbildung 7B). Messen Sie die Strahlprofile mit einer kalibrierten Kamera. Alternativ können Sie eine Infrarotkarte verwenden und die Durchmesser mit dem Auge abschätzen. Verwenden Sie zwei Teleskope, eines für die Pumpe und eines für den Stokes-Strahl. Versuchen Sie mit diesen Teleskopen, die Strahldurchmesser an die hintere Apertur des Anregungsobjektivs anzupassen.HINWEIS: Dieses Verfahren garantiert die maximale räumliche Auflösung des Setups. Sobald das SRS-Signal erhalten wurde, verwenden Sie das Teleskop am Pumpstrahl, um seinen Durchmesser zu optimieren und seinen Rayleigh-Bereich und damit das Interaktionsvolumen im Fokus des Mikroskops zu variieren. Stoppen Sie, wenn der maximale SRS erreicht ist. Verwenden Sie eine Fotodiode, um die Intensität des Pumpstrahls (Stokes) zu messen und mit der Reaktionsfähigkeit der Fotodiode die mittlere Leistung zu berechnen, die auf den aktiven Bereich des Detektors auftrifft. Wenn Sie eine Photodiode mit hoher Bandbreite verwenden, schließen Sie einen elektronischen Tiefpassfilter an, um nur die konstante oder DC-Komponente zu erhalten. Um δP(f) zu messen, schließen Sie den Ausgang einer Fotodiode mit hoher Bandbreite (trennen Sie den Tiefpassfilter) an den Eingang eines Lock-in-Verstärkers an. Speichern Sie den Lock-in-Ausgang bei verschiedenen Demodulationsfrequenzen und verwenden Sie die Empfindlichkeit der Fotodiode, um von V nach W umzuwandeln.HINWEIS: Kommerzielle Lock-in-Verstärker verfügen über integrierte Tools zur Messung von δP(f) (z. B. Zurich Instruments, die in LabOne einen Frequenzkehrer31 integriert haben). Nachdem Sie den RIN der Strahlen gemessen haben, schalten Sie den Laser aus und messen Sie das elektronische Rauschen (d. h. den RIN, der ohne Licht auf den Detektoren berechnet wird).HINWEIS: Vorausgesetzt, dass der RIN durch die Laserschwankungen und nicht durch das Schussrauschen begrenzt wird, hilft diese Dunkelmessung, die für die Messungen verwendete Instrumentierung zu diagnostizieren; wenn das elektronische Rauschen so hoch ist wie der RIN des Lasers, kann dies nicht zur Messung des RIN des Lasers verwendet werden; Ultra-Low-Noise-Verstärker müssen möglicherweise verwendet werden, um das elektronische Rauschen zu reduzieren. Wenn der RIN durch das Schussrauschen und nicht durch die Laserfluktuation begrenzt ist, strahlen Sie mehr optische Leistung auf den Detektor. Siehe Abbildung 8. 3. Einrichten der spektralen Detektion für die SRS-Bildgebung Führen Sie die Pumpe und die Stokes-Strahlen zum Mikroskop. Platzieren Sie die in Abschnitt 1 beschriebene Probe, und suchen Sie einen Bereich ohne Perlen, um den Pumpenstrahl auszurichten. Messen Sie mit einer Kamera das reflektierte Profil des Stokes-Strahls (Pumpe), während die Pumpe blockiert wird (Stokes). Passen Sie die Positionen der Laserspots mit den Spiegeln direkt vor dem Mikroskop an.HINWEIS: Um die höchste SRS-Generation zu erhalten, sollten sie sich perfekt überlappen. Abbildung 9 zeigt (A) die Pumpe, (B) Stokes und (C) beide Strahlen überlappen sich perfekt in der Brennebene des Mikroskops. Machen Sie die Erregungs- und Sammelziele konfokal.HINWEIS: Die Verwendung von unendlich korrigierten Objektiven bedeutet, dass die Fokussierung der Pumpe auf die Probenebene zu einem kollimierten Strahl an der hinteren Apertur des Entnahmeobjektivs führt. Setzen Sie einen Kurzpassfilter ein, um die modulierten Stokes zu entfernen und den Pumpenstrahl zum Gitter zu führen. Platzieren Sie eine Linse nach dem Gitter, um den verteilten Strahl auf die Detektoren zu fokussieren.HINWEIS: Die Gittergleichung hilft bei der Bestimmung der linearen Dispersion (d.h. wie viel nm pro mm an der Detektorebene mit einer Linse einer gegebenen Brennweite f32). Die Gittergleichung bezieht sich auf die Rillenperiodizität d des Gitters, den Einfallswinkel α, den Beugungswinkel β , die gebeugte Wellenlänge λ und die Beugungsordnung m (Eq [2]). (2) Für eine ausgewogene Detektion messen Sie das Spektrum der Referenz und die Signalnachbildungen, die sich entlang des Pumpenstrahls ausbreiten.HINWEIS: Das räumliche Profil des Pumpenstrahls nach dem Gitter ist eine Linie, die die verschiedenen spektralen Komponenten der Breitbandpumpe entlang ihrer Länge umfasst. Jede spektrale Komponente der Pumpenleitung wird im Abstand f durch eine sphärische Linse fokussiert (siehe Schritte 3.1-3.2). Um ein Beschneiden der dispergierten Pumpe zu vermeiden, platzieren Sie die sphärische Linse so nah wie möglich am Gitter. Setzen Sie ein PBS direkt nach der sphärischen Linse ein, um die Pumpenrepliken zu trennen.HINWEIS: Hier wurde ein polarisierender Würfelstrahlteiler verwendet, da diese Art von Polarisator die Polarisation des Pumpenstrahls nicht durcheinander bringt. Es trennt auch effektiv die verschiedenen Pumpennachbildungen und kann groß genug sein, um ein Beschneiden der Breitbandpumpe zu vermeiden. Das PBS reflektiert die Signalreplik (s-polarisiert) und überträgt die Referenzreplik (p-polarisiert). Führen Sie mit einem Paar Lenkspiegel das Signal und den Verweis auf ihre jeweiligen Detektoren (Abbildung 1).HINWEIS: In der idealen symmetrischen Konfiguration sollten die Signal- und Referenzrepliken die gleiche optische Leistung haben. Um das Rauschen im Pumpstrahl zu entfernen, korrelieren Sie die Kanäle des Photodiodenarrays, das das Signal misst, mit ihren Gegenstücken im Referenzdetektor. Stellen Sie daher sicher, dass dien-te Photodiode des Signals und die Referenz-Photodiodenarrays die optische Leistung derselben spektralen Komponente des Signals und der Referenzrepliken messen.HINWEIS: Abbildung 8 zeigt beispielhafte RIN-Spektren. Um die spektrale Anpassung zwischen den beiden Photodiodenarrays zu gewährleisten, platzieren Sie einen kleinen Schlitz oder eine Iris zwischen dem Gitter und dem PBS, um die dispergierte Pumpe räumlich zu filtern. Schneiden Sie alle bis auf eine Spektralkomponente der Pumpe nach, um die übertragenen Strahlen auf demn-ten Detektor der Referenz- und Signalphotodiodenarrays zu zentrieren. Verwenden Sie die genannten Lenkspiegel, um die Korrelation der verschiedenen Erfassungskanäle einzustellen. Starten Sie an dieser Stelle die SRS-Mikroskopie. Modulieren Sie dazu die Stokes, scannen Sie die Probe per Raster und erfassen Sie die Modulationsübertragung auf dem Pumpenspektrum (ΔI) mit dem entsprechenden DC-Spektrum (I), um das normalisierte SRS (ΔI / I) -Spektrum von jedem Pixel zu erhalten. Erstellen Sie dreidimensionale Matrizen, deren Zeilen (x) und Spalten (y) die gescannten Positionen der Stichprobe enthalten. Speichern Sie auf jedem Vektor (z) orthogonal zur x-y-Ebene ein SRS-Spektrum.HINWEIS: Abbildung 12 zeigt die Struktur der hyperspektralen SRS-Daten. Stellen Sie die Leistung des Stokes-Strahls auf 65 mW und die des Breitband-Pumpstrahls auf 20 mW ein. Legen Sie einen idealen Integrationszeitpunkt für die Experimente fest.HINWEIS: Hier betrug die Integrationszeit 44 μs; Die Pixelverweilzeit betrug jedoch aufgrund des langsamen Piezoscanners 1 ms. 4. Chemometrie hyperspektraler SRS-Daten Verwenden Sie die multivariate Kurvenauflösungsanalyse, um die verschiedenen chemischen Bestandteile der Probe zu entwirren. Laden Sie die grafische Benutzeroberfläche über den Link in Tauler, de Juan undJaumot 33 herunter.HINWEIS: Hier wurde das von Tauler und Mitarbeitern entwickelte MATLAB-Programm Multivariate Curve Resolution-Alternating Least Squares (MCR-ALS) verwendet34,35. Für Anwendungen von MCR-ALS auf SRS-Daten siehe 36,37; Ausführliche Erläuterungen zum Algorithmus finden Sie unter 38. Gestalten Sie in MATLAB den hyperspektralen SRS-Datenwürfel in eine Matrix D mit ihren Zeilen, die die SRS-Spektren enthalten. Angenommen, der entfaltete SRL-Hyperwürfel D ist eine lineare Kombination aus der Konzentration C und den Spektralprofilen S der chemischen Bestandteile der Probe (d. h. D = CS T + E, wobei E eine Matrix ist, die den experimentellen Fehler enthält, und das hochgestellte T die Matrixtransposition anzeigt). Rufen Sie die Hauptkomponenten der Daten ab, um C und S zu trennen. Da a priori bekannt ist, dass die in Abschnitt 1 diskutierte Probe vier Arten enthält, nämlich DMSO, Olivenöl, PMMA und PS, konfigurieren Sie das Programm so, dass es nach vier Arten und einer weiteren sucht, um das Hintergrundrauschen zu berücksichtigen. Wenn es eine andere Stichprobe mit einer höheren oder niedrigeren Anzahl von Arten gibt, konfigurieren Sie das Programm entsprechend.HINWEIS: Das Programm nimmt eine singuläre Wertzerlegung der Spektraldaten vor und verwendet sie als erste Vermutungen der reinen Spektren S. Alternativ füttern Sie das Programm mit einer Matrix, die die bekannten spektralen Spuren enthält (z. B. die spontanen Raman-Spektren der Substanzen).HINWEIS: Unter Verwendung der anfänglichen Schätzungen der reinen Spektren berechnet das Programm C = DS (S T S) − 1 und ST = (C T C) − 1CTD. Die neuen Werte von C und S werden mit einem abwechselnden Algorithmus der kleinsten Quadrate optimiert. Da SRS ein nichtnegatives Signal ist, beschränken Sie den alternierenden Algorithmus der kleinsten Quadrate, um nur positive Werte zu liefern.HINWEIS: Das optimierte C und S ermöglichen die Konstruktion einer neuen Matrix D * = CST, einem Datensatz, den das Programm mit den ursprünglichen Daten D vergleicht. Das Programm iteriert diese Schritte automatisch, bis die Differenz zwischen D* und D kleiner als ein beliebiger Schwellenwert ist, der definiert werden kann. Diagramm C und S , um chemische Bilder und die charakteristischen Spektren der chemischen Bestandteile der Probe aufzunehmen.

Representative Results

Abbildung 3 zeigt beispielhafte Ergebnisse, die mit diesem Protokoll mit PS, PMMA und Olivenöl erzielt wurden. Diese Rotation von LBO1 verändert den Brechungsindex des SHG-Feldes und ändert direkt seine Phasengeschwindigkeit. Wenn die Phasengeschwindigkeit des SHG-Feldes mit der der in LBO1 induzierten nichtlinearen Polarisation übereinstimmt, befinden sich das nichtlinear erzeugte Feld und die nichtlineare Polarisation in Phase, was zu intensiver SHG-Strahlung führt. Mit anderen Worten, die Optimierung des φWinkels von LBO 1 ermöglicht es dem Benutzer, die ideale Phasenanpassungsbedingung für SHG zu erreichen. Da hier ein Typ-I-Phasenanpassungskristall verwendet wird, ist die Polarisation des SHG-Strahls orthogonal zu der des Grundstrahls (Abbildung 5B). Abbildung 8 zeigt den RIN der in diesem Protokoll verwendeten optischen Quellen und die Shot-Noise-Grenze, die eine Folge der Quantennatur von Elektronen und Photonen ist, die dem Laserrauschen eine grundlegende Grenze setzt. Der Schussrausch-begrenzte RIN wird berechnet , wie von Eq (3) gezeigt. (3) Dabei ist h die Plancksche Konstante und ν die optische Frequenz. Somit liefert das Schussrauschen nützliche Richtlinien für das Elektronikdesign. Abbildung 11A und Abbildung 11C zeigen beispielhafte Daten von ausgeglichenen und unausgeglichenen Spektren. Natürlich beeinflussen die Auswirkungen eines ausgewogenen Nachweises die Endergebnisse der Experimente, nämlich die chemischen Karten. Abbildung 11B und Abbildung 11D zeigen zusammengesetzte Bilder unter unausgeglichenen bzw. ausgeglichenen Bedingungen. Die erfolgreiche Implementierung des beschriebenen Protokolls wird dazu beitragen, die verschiedenen chemischen Bestandteile einer heterogenen Probe zu identifizieren und zu lokalisieren und ihre charakteristischen SRS-Spektren zu extrahieren. Setzt man die hyperspektralen Daten von Abbildung 12 einer chemometrischen Analyse aus, so ergibt sich Abbildung 13. Abbildung 13A zeigt eine Zusammensetzung der Konzentrationskarten der verschiedenen chemischen Bestandteile der Probe, während Abbildung 13B ihre charakteristischen SRS-Spektren zeigt. Beachten Sie, dass die in Abbildung 13A gezeigten Daten es dem Benutzer nicht nur ermöglichen, die verschiedenen Bestandteile der Stichprobe leicht zu identifizieren, sondern auch eine quantitativere Analyse durchzuführen. Zum Beispiel könnten wir unter Verwendung der Konzentrationskarten den Mittelwert der fraktionierten Konzentration jeder chemischen Spezies berechnen: 38% DMSO, 25% PMMA, 14% PS und 22% Olivenöl. Abbildung 1: Schematische Darstellung des in diesem Protokoll verwendeten Breitband-SRS-Mikroskops. Abkürzungen: PBSx = polarisierender Strahlteiler; SHG = zweites harmonisches Erzeugungsmodul; OPO = optischer parametrischer Oszillator; AOM = akusto optischer Modulator; SPF = Kurzpassfilter; M-LIA: Mehrkanal-Lock-in-Verstärker; DM = dichroitischer Spiegel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 2: Spektren der abstimmbaren Breitbandpumpe (blau) und der schmalbandigen (rot) Stokes-Strahlen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 3: Hellfeldbild der chemisch heterogenen Probe. Beachten Sie, dass die herkömmliche Mikroskopie es nicht erlaubt, die verschiedenen Bestandteile zu unterscheiden. Maßstabsleiste = 100 μm. Abkürzungen: PS = Polystyrol; PMMA = Polymethylmethacrylat; DMSO = Dimethylsulfoxid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 4: Modulation der schmalbandigen Stokes-Impulse . (A) Die transparente blaue Spur zeigt den 0.gebeugten Strahl, während die schwarze die entsprechende 1. Ordnung zeigt . (B) Optischer Aufbau zur Optimierung der Modulationseffizienz des gebeugten Strahls 1. Ordnung und Feinabstimmung der Spotgröße des Stokes-Strahls vor Erreichen des Anregungsobjektivs. Abkürzungen: AOM = acousto optic modulator; fx = Brennweite des Objektivs X. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 5: Nichtlineare optische Prozesse, die zum Antrieb des OPO erforderlich sind. (A) Geometrie der SHG-Wechselwirkung. Zwei fundamentale Photonen beiω 1 bringen das Materialsystem auf eine hochenergetische virtuelle Ebene, von wo aus das Materialsystem in den Grundzustand springt und ein Photon bei ωSHG emittiert. (B) Schema des SHG-Experiments. (C) Ein Schema der SHG- und OPO-Setups. (D) Geometrie der DFG-Wechselwirkung. Ein ω SHG-Photon wird in die Signal- (ω-Signal) undIdler-Photonen (ωIdler) aufgeteilt. Eine Verstärkung des Signalstrahls wird erreicht, indem die Signalphotonen zurückgespeist und sie im Hohlraum mitschwingen lassen. (E) Schema des DFG-Experiments. Abkürzungen: SMx = Kugelspiegel (R = 75 mm); OPO = optischer parametrischer Oszillator; SHG = zweites harmonisches Erzeugungsmodul; DFG = Differenzfrequenzerzeugung; LBO = Lithiumtriborat; OC = Ölkondensator; DM = dichroitischer Spiegel; fx = Brennweite des Objektivs X. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 6: Geometrie des Prismenkompressors. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen. Abbildung 7: Summenfrequenzgenerierung zur Optimierung der raumzeitlichen Überlappung . (A) SFG zwischen der Pumpe und Stokes und deren jeweiliges SHG-Auftreffen auf einem Bildschirm. Hier fokussierte eine Linse die Pumpe und die Stokes-Strahlen auf den Kristall, während ein Tiefpassfilter sie entfernte. (B) Intensität des SFG zwischen Pumpe und Stokes in Abhängigkeit von der Zeitverzögerung. Legen Sie die Zeit-Null des SRS-Setups an der Position fest, die die SFG maximiert. Die Asymmetrie der Kreuzkorrelation in B ist auf das zeitliche Profil zurückzuführen, das durch das Etalon auf dem Stokes-Balken verursacht wird. Abkürzungen: SFG = Summenfrequenzerzeugung; SHG = zweites harmonisches Erzeugungsmodul; SRS = stimulierte Raman-Streuspektroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 8: RIN-Spektren Das grün hervorgehobene Band zeigt die beste Spektralregion für die SRS-Experimente. Die Modulation des Stokes-Strahls bei jeder Frequenz innerhalb dieses Bandes garantiert, dass die Auswirkungen des Laserrauschens auf das SRS-Signal so gering wie möglich sind. Abkürzungen: RIN = Rauschen mit relativer Intensität; SRS = stimulierte Raman-Streuspektroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 9: Strahlprofile . (A) Pumpe, (B) Stokes und (C) Pumpe und Stokes. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 10: Angenommene Geometrie für ein Dispersionsgitter und einen Photodiodenarray-Detektor. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 11. Die Auswirkungen einer ausgewogenen Erkennung. Auswirkungen auf Spektren (A, C) und chemische Bilder (B, D). Die in den Panels (B) und (D) gezeigten Verbundwerkstoffe sind die endgültigen Ergebnisse der Experimente (d.h. nach chemometrischer Analyse von Hyperspektraldaten). Siehe Protokollabschnitt 4 für Details). Maßstabsstäbe = 10 μm. Abkürzung: SRS = stimulierte Raman-Streuspektroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 12: Ein repräsentativer SRS-Hyperwürfel, der mit breitbandiger SRS-Mikroskopie aufgenommen wurde. Die x-y-Ebene speichert die Koordinaten der gescannten Positionen, während jeder Vektor entlang z ein SRS-Spektrum registriert. Abkürzung: SRS = stimulierte Raman-Streuspektroskopie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen. Abbildung 13: Chemometrische Analyse hyperspektraler SRS-Daten . (A) Zusammenstellung der Konzentrationskarten der verschiedenen Bestandteile der Probe. (B) Charakteristische Spektren der chemischen Spezies. In beiden Paneelen gelb: Olivenöl, blau: DMSO, cyan: PS und orange: PMMA. Maßstabsleiste = 20 μm (A). Abkürzungen: SRS = stimulierte Raman-Streuspektroskopie; PS = Polystyrol; PMMA = Polymethylmethacrylat. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.

Discussion

Die Breitband-SRS-Mikroskopie ist eine leistungsstarke Bildgebungstechnik, die einen authentischen chemischen Kontrast bietet, um die chemischen Bestandteile einer heterogenen Probe zu identifizieren und zu entwirren. Das Potenzial dieses Analysewerkzeugs kann für mehrere Forschungsbereiche von Vorteil sein, von der Materialwissenschaft bis zur Histopathologie. Der Nachteil der Breitband-SRS-Mikroskopie ist die Tatsache, dass sie technisch anspruchsvoll ist; Der Experimentalist benötigt nicht nur Know-how über breitbandige Laserquellen, sondern muss auch die Laserpulse manipulieren, um SRS effizient zu erzeugen, ein Signal, das wiederum mit ausgeklügelten Detektionsschemata gemessen werden muss. Dieses Papier stellt ein Protokoll vor, das einen Workflow zur Erstellung chemischer Karten gemischter chemischer Verbindungen mit einem Multiplex-Breitband-SRS-Mikroskop beschreibt. Obwohl die beschriebene Arbeit für einige Laserphysiker und nichtlineare Mikroskopiker trivial sein mag, ist dies möglicherweise nicht der Fall für Leser, die an den Vorteilen der Breitband-SRS-Mikroskopie interessiert sind, deren wissenschaftliche Erkenntnisse außerhalb dieser Bereiche liegen. Daher wollten wir jeden Schritt detailliert beschreiben, um das breite Publikum, das an Breitband-SRS-Mikroskopie interessiert ist, zu führen.

Das vorliegende Protokoll begann damit, zu zeigen, wie man eine einfache, aber spektroskopisch reiche Probe vorbereitet, die aus mehreren starken und bekannten Raman-Streuern besteht. Wir diskutierten, wie man die Breitbandpumpe und die schmalbandigen Stokes-Strahlen erhält, die für die Einrichtung eines SRS-Mikroskops erforderlich sind. Abbildung 5C zeigt ein Schema der SHG- und OPO-Setups. Beachten Sie, dass Linse f 1 den Grundstrahl auf LBO₁ fokussiert, um das SHG zu erzeugen_, während ein dichroitischer Spiegel die SHG-Strahlung reflektiert und den verbleibenden Grundstrahl überträgt. Ein zweites Objektiv f₂ kollimiert den SHG-Strahl. Als f2 > f 1 wird der SHG-Strahl um einen Faktor gleich f₂/f₁ erweitert. Ein drittes Objektiv f₃ fokussiert den expandierten SHG-Strahl auf einen zweiten Typ I LBO-Kristall (LBO₂), der bei θ = 90° und φ = 29,0° geschnitten wurde. Durch das Pumpen von LBO 2 mit dem oben genannten SGH (520 nm) wird Strahlung im Bereich von 680-910 nm von LBO₂ durch Differenzfrequenzerzeugung (DFG) ausgehen und zwei Strahlen erzeugen: das Signal und der Leerlauf²⁷ (Abbildung 5D, E). Letzteres wird verworfen, während ersteres im OPO-Hohlraum verstärkt wird, um die in den SRS-Experimenten verwendeten Pumpimpulse zu liefern. Die Pumpe des OPO bei 520 nm, nämlich der SHG-Strahl, sollte nicht mit der Pumpe der SRS-Experimente (d.h. dem Signalstrahl des OPO) verwechselt werden.

Der Kontrast in der SRS-Mikroskopie stammt von einem nichtlinearen Signal, das am Brennpunkt des Mikroskops erzeugt wird, ein Signal, das die Eingrenzung einer großen Anzahl von Photonen in der Probenebene zu einem bestimmten Zeitpunkt erfordert. Dieser Photoneneinschluss wird mit einem Mikroskopobjektiv mit hoher numerischer Apertur (NA) erreicht, einer Reihe von Linsen, die auch die räumliche Auflösung des Systems festlegen: Je höher die NA, desto höher die räumliche Auflösung. Hohe NA-Objektive sind jedoch dicht mit Glas gefüllt, was positive GDD in gepulste Strahlung einführt, ein Frequenzzwitschern, der letztendlich das zeitliche Profil der Impulse³⁹ erweitert. So könnte die durch das mikroskopische Ziel eingeführte GDD die Dauer der Breitbandpumpenimpulse erhöhen, sie noch länger als die zeitliche Hülle von Stokes machen und die effektive, zugängliche Bandbreite des Raman-Signals verringern. Darüber hinaus könnte diese Erweiterung auch zu einer Verzerrung des spektralen Profils des gemessenen SRS-Spektrums führen.

In CARS entsteht das spektroskopisch relevante Signal bei Wellenlängen, die sich von denen der Anregungsfelder unterscheiden. Eine einfache Photomultiplierröhre oder eine CCD-Kamera (charge-coupled device) kann verwendet werden, um das CARS-Signal rechtzeitig zu integrieren und Tausende von Impulsen zusammenzufassen, um das Laserrauschen zu mitteln. Stattdessen erscheint das SRS-Signal als schwache Modulationsübertragung, eingebettet in einen starken und schwankenden Laserhintergrund. Da diese Modulation schwach ist, kann das Laserrauschen sie leicht überwältigen und sowohl die Bildgebungsgeschwindigkeit als auch die Empfindlichkeit des SRS-Mikroskops reduzieren. Daher ist es vor der Bildgebung unerlässlich, das relative Intensitätsrauschen (RIN) zu messen, um festzustellen, ob der Laser für die Hochgeschwindigkeits-SRS-Bildgebung geeignet ist, und um die Modulationsfrequenz mit dem geringsten Rauschen auszuwählen. Die RIN ist definiert als die spektrale Rauschleistungsdichte [δP(f), mit W²/Hz-Einheiten] des Lasers, normiert durch die mittlere optische Leistung ()^40,41. Mit anderen Worten, der RIN beschreibt die normalisierten Laserfluktuationen bei verschiedenen Frequenzen (Eq [4]).

(4)

Somit ist der RIN ein Parameter des SRS-Systems, der den idealen Modulationsfrequenzbereich für die Experimente bestimmt. Beispielsweise zeigt der Olivenbalken in Abbildung 8 den idealen Modulationsfrequenzbereich für die SRS-Bildgebung. Im Falle von Schmalband-SRS sollte der Benutzer die RIN sowohl der Pumpe als auch von Stokes messen, um auszuwählen, welcher Strahl moduliert werden muss, um eine optimale Leistung zu erzielen. Beachten Sie beispielsweise aus Abbildung 8, dass der Stokes-Strahl eine etwas höhere RIN als die Pumpe aufweist, was bedeutet, dass die SRG-Messungen lauter ausfallen würden als ihre SRL-Gegenstücke. Im Falle von Breitband-SRS ist der Strahl, der moduliert werden sollte, der schmalbandige Strahl.

Die Winkeldispersion D des Gitters drückt den Beugungswinkel als Funktion der Wellenlänge aus und ist definiert als Ableitung der Gittergleichung. Für die Littrow-Konfiguration ist die Winkeldispersion durch Eq (5) gegeben.

(5)

Um Eq (5) zu erhalten, nahmen wir α = β an , lösten Eq (2) für m/d und fügten das Ergebnis in d β/ d λ ein. Beachten Sie, dass in der Littrow-Konfiguration β = sin-1(mλ/2 d) ist. Innerhalb der Kleinwinkelnäherung ist die Positionsänderung entlang des Spektrums fdβ ≈ dl (Abbildung 10). Durch Einfügen von dβ in Eq (5) können wir also die lineare Dispersion berechnen, eine Größe mit Einheiten von nm ^mm-1 unter Verwendung von Eq (6):

(6)

Für ein Beugungsgitter in der Littrow-Konfiguration mit 1.851,85 Rillen/mm, d = 540 nm. Wenn wir die Beugung des Lichts erster Ordnung bei ~ 789 nm verwenden, ist D = 0,0027 rad nm-1. Mit einem f = 750 mm Objektiv erhalten wir eine lineare Dispersion von ≈ 0,5 nm mm-1, was ≈ 7,8 cm-1 ^mm-1 entspricht. So bestimmt die Brennweite der Linse die “Dichte” von nm pro mm auf der Detektorebene: Je länger die Brennweite, desto weniger nm pro mm erhalten wird, wodurch der Abstand zwischen den Spektrallinien der Breitbandpumpe vergrößert wird. Umgekehrt wird es bei kürzeren Brennweiten mehr nm pro mm auf der Detektorebene geben, wodurch der von der dispergierten Pumpe belegte Raum reduziert wird.

Die ausgewogene Erkennung verbessert die Bildqualität und Empfindlichkeit von verrauschten Setups. Gemäß den in Abbildung 8 gezeigten RIN-Spektren und unter Berücksichtigung typischer SRS mit einer Amplitude von 1 x 10-5 beträgt beispielsweise das unsymmetrische Signal-Rausch-Verhältnis (SNR) ≈60. Durch symmetrische Erkennung (d.h. nahe am Schussrauschen) ist es möglich, ein SNR von ≈145 zu erreichen. Abbildung 11 zeigt Spektren und zusammengesetzte Bilder unter ausgeglichenen und unsymmetrischen Bedingungen. Natürlich beeinflussen die Auswirkungen eines ausgewogenen Nachweises die Endergebnisse der Experimente, nämlich die chemischen Karten. Unterstützt durch diese Ergebnisse betonen wir, dass die ausgewogene Erkennung eine leistungsstarke Technik ist, um den nachteiligen Auswirkungen von Laserschwankungen auf die Bildqualität entgegenzuwirken. Es ist erwähnenswert, dass die symmetrische Detektion am besten für verrauschte Laser wie Faseroszillatoren geeignet ist. SRS-Mikroskope, die mit leisen optischen Lichtquellen (z. B. Festkörperlasern) arbeiten, erfordern möglicherweise keine ausgewogene Detektion.

Das Protokoll erklärt auch einen Ansatz, der auf nichtlinearer Optik basiert, um die raumzeitliche Überlappung zwischen den Impulsen dieser Strahlen zu finden. Wir beschrieben die Vorteile der Verwendung der 1.^anstelle der^0. Beugungsordnung eines AOM als modulierten Stokes-Strahl. Darüber hinaus wurden die nachteiligen Auswirkungen der Dispersion auf die SRS-Erzeugungseffizienz mit Vorschlägen beschrieben, wie sie über einen Prismenkompressor gemildert werden können. Darüber hinaus erklärt das Protokoll, wie die Prismen ausgerichtet werden, und hebt drei kritische Aspekte hervor, die für eine optimale Leistung zu berücksichtigen sind. Wir diskutieren nicht nur die Relevanz des RIN für die SRS-Mikroskopie, sondern zeigen auch, wie man ihn mit einem Lock-in-Verstärker misst und mit dem RIN-Spektrum die beste Modulationsfrequenz definiert. In diesem Beitrag wird anhand eines konkreten Beispiels erläutert, wie die Gittergleichung bei der Gestaltung der Erfassungskette hilft. Schließlich veranschaulicht das Protokoll mit realen SRS-Daten die Struktur des SRS-Hyperwürfels und wie man ihn mit einer konventionell verwendeten wissenschaftlichen Programmiersprache analysiert.

Dieses Protokoll hat drei kleinere Einschränkungen. Erstens besteht das in diesem Beitrag verwendete Detektionsschema aus einem nichtkonventionellen, mehrkanaligen Lock-in-Detektor, der von Sciortino et al. im eigenen Haus entwickelt und gebaut ^wurde.26 Wie bereits^{gezeigt 25}, kann dieser Detektor durch eine handelsübliche symmetrische Photodiode ersetzt werden. Obwohl diese Modifikation nur den Detektor betrifft und das Protokoll praktisch unverändert lässt, muss man bei einer Einzelphotodiode jede spektrale Komponente auf dem Detektor scannen, anstatt sie alle auf einmal zu messen. Zweitens verwendet dieses Protokoll die Inline-Balanced-Erkennung, bei der mehrere optische Elemente in den Strahlpfad eingefügt werden müssen. Diese optischen Elemente erhöhen die Systemkomplexität und führen zu Verlusten an optischer Leistung und Pulsverbreiterung.

Die Inline-Balanced-Detektion erfordert auch, dass die beiden Pumpenrepliken die Probe passieren, eine Situation, die für lichtempfindliche Proben wie lebende Zellen oder für stark doppelbrechende Proben, bei denen die beiden Pumpennachbildungen unterschiedliche optische Eigenschaften aufweisen können, möglicherweise nicht ideal ist, wodurch die ausgewogene Erkennung aufgehoben wird. Drittens basiert das Protokoll auf einem selbst gebauten OPO, einem Gerät, das möglicherweise nicht ohne weiteres verfügbar ist. Alternativen zu den vom OPO gelieferten Breitbandspektren sind jedoch die Supercontinua von nichtlinearen optischen Fasern oder Bulk-Kristallen. Letzteres konnte nur mit Lasern mit niedriger Wiederholungsrate (bis zu 5 MHz) eingesetzt werden. Wie bei jedem experimentellen Design hat das vorliegende Protokoll einige Einschränkungen. Sie sind jedoch minimal und beeinträchtigen nicht den Erfolg dieses Ansatzes.

Obwohl hier eine Referenzprobe beschrieben wird, kann dieses Protokoll chemische Spezies erfolgreich in Zellen und tierischem und pflanzlichem Gewebe wie Cellulose, Lipidspezies oder Proteinen entwirren und praktische Anwendungen in verschiedenen biochemischen Quests oder als Diagnosewerkzeug in der Histopathologie finden. Ebenso kann dieses Protokoll ein wertvolles Werkzeug in den Materialwissenschaften sein. Zum Beispiel kann man nach diesem Protokoll die molekulare Zusammensetzung und Konzentration der polymeren Spezies⁴² abfragen. Darüber hinaus ist diese Methodik kompatibel mit anderen nichtlinearen Mikroskopietechniken, wie der Breitbandmikroskopie auf Basis von Pump-Probe⁴³ und heterodynen CARS⁴⁴, Vierwellen-Mischprozessen, die wie bei SRS auch zwei Anregungslichtstrahlen und Modulations-Transfer-Messungen erfordern. Schließlich können einige der in diesem Papier enthaltenen Informationen auf nichtlineare Bildgebungsverfahren angewendet werden, die nicht auf Modulationsübertragungstechniken beruhen, sondern die Ausrichtung von zwei oder mehr gepulsten Laserstrahlen erfordern, wie z. B. herkömmliche CARS^45- und SFG-Mikroskopie⁴⁶.

Zusammenfassend beschreibt dieses Protokoll eine leistungsstarke Methodik, die auf breitbandiger SRS-Mikroskopie basiert, um chemische Karten und ihre charakteristischen SRS-Spektren aus chemisch heterogenen Gemischen zu extrahieren und Datensätze zu liefern, die eine einfache quantitative Datenanalyse ermöglichen. Die Vielseitigkeit und Einfachheit der Methode geben dem interessierten Leser auch die Möglichkeit, sie an verschiedene nichtlineare Techniken anzupassen.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D. P. würdigt die Finanzierung aus dem EU-Projekt CRIMSON im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 101016923 und dem Projekt NEWMED aus der Region Lombardei im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. POR FESR 2014-2020. G. C. würdigt die Förderung aus dem EU-Projekt GRAPHENE Core3 unter der Fördervereinbarung Nummer 881603. G. C. würdigt auch die Finanzierung durch die King Abdullah University of Science and Technology, Grant Award Number: OSR-2016-CRG5-3017-01.

Materials

Collection objective	Nikon	CFI Apo Lambda S 60x Oil, NA=1.4, Nikon	Oil immersion objective
Coverslips	Thermo Fisher	043211-KJ	Quartz, cover slip for microscope slide, 25.4 x 25.4 x 0.15 mm
Delay line	Physik Instrumente (PI)	M-406.6PD	Precision microtranslation stage, 150 mm travel range
DMSO	Merck	D8418-500ML	Methylsulfinylmethane, Molecular Biology Grade DMSO, DMSO, Methyl Sulfoxide
Etalon	SLS Optics Ltd	Custom made	Anti reflective coating at 1,040 nm, Mounted in a 38 mm diameter x 35.5 mm long stainless steel cell with protective dust caps, and a 50 mm diameter ‘pinch-clamp’ mounting ring
Excitation objective	Nikon	CFI Plan Apo IR 60XC WI, NA=1.27, Nikon	Water immersion objective
Grating	LightSmyth	T-1850-800s Series	High Efficiency Transmission Grating T-1850-800s Series
Laser	Coherent	Custom made	Fidelity, HP
λ/2	Thorlabs	SAHWP05M-1700	Mounted superachromatic half-wave plate
PBS	Thorlabs	CM5-PBS203/M	16 mm Cage-Cube-Mounted Polarizing Beamsplitter Cube,
PMMA beads	Merck	MFCD00198073	Micro particles based on polymethacrylate
Prisms	Crisel	320-8218	LASER DISPERSING PRISMS in SF11
PS beads	Merck	72986-10ML-F	Micro particles based on polystyrene
YVO4 crystal	Dr. Sztatecsny GmbH	Custom made	thickness 8 mm, dia 1.00 cm, 1 689,00 689,00 suitable for 1" mount, coated for 850 – 1,100 nm

Referências

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De la Cadena, A., Vernuccio, F., Talone, B., Bresci, A., Ceconello, C., Das, S., Vanna, R., Cerullo, G., Polli, D. Multiplex Chemical Imaging Based on Broadband Stimulated Raman Scattering Microscopy. J. Vis. Exp. (185), e63709, doi:10.3791/63709 (2022).