基于宽带受激拉曼散射显微镜的多重化学成像

1. 样品制备 注意：该协议描述了化学非均相混合物的浓度图和特征SRS光谱的检索。 为了制备样品，从聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）微珠的水悬浮液中提取2μL（参见 材料表），并将2μL级分倒入显微镜盖玻片上。 使用干净的移液器吸头，从聚苯乙烯（PS）微珠的水悬浮液中提取2μL，并将其与盖玻片上的PMMA悬浮液结合。使用移液器吸头，轻轻混合悬浮液，使其干燥24小时。注意：重要的是要仔细匹配微珠悬浮液的浓度，以避免样品表面上出现不成比例的微珠。PS和PMMA磁珠的直径分别为10和6 μm。这些尺寸允许在不影响SRS生成效率的情况下展示显微镜的高空间分辨率。 在水干涸时会出现的平坦的白色珠子层上，加入20μL二甲基亚砜（DMSO），然后加入20μL纯橄榄油。 在第二个显微镜盖玻片的边缘涂抹指甲油。将盖玻片放在混合物上，指甲油朝下，施加足够的压力将其密封。让它干燥。注： 图3 显示了通过这些步骤获得的示例性结果。如果密封得当，该样品应持续长达三个月。 2. 优化泵和斯托克斯梁 打开激光器，让它达到热平衡。将 GDD = -6，000 fs2 的负群延迟色散 （GDD） 应用于基波束。注意：此 GDD 值对于成功驱动 OPO 至关重要，并且是此设置的最佳值，但在不同的系统中可能会有所不同。负GDD可以通过光栅对、棱镜压缩器或基于空间光调制器28的脉冲整形器引入。 使用偏振分光镜（PBS1）将基波激光器分成两个分支。要获得窄带斯托克斯脉冲，请将一个4 W的分支引导到一个etalon。稍微旋转etalon，直到获得一条狭窄的光谱线，并在脉冲光谱的峰值处居中（参见 图2中的红色曲线）。注意：该etalon在1，040 nm处的有效精细度为29，自由光谱范围为29.8 nm。 要获得调制的斯托克斯脉冲，请将窄带光束发送到声光调制器。注意：如图 4A所示，一阶衍射光束经历100%调制，而零阶光束仅50%。因此，优选采用一阶以避免用强烈的未调制光束照亮样品，这可能会在不产生任何SRS信号的情况下诱导样品光损伤。 为了优化调制效率，请更改镜头f1 和f2 之间的距离（图4B）。用光电二极管测量调制光束，并用示波器记录其轮廓。 更改 f1 和 f2 之间的距离，直到幅度和示波器读数基线之间达到最大对比度。注意：这对镜头不作为准直器工作，而是在AOM晶体处产生有效的焦点。 放置第三个透镜f3 以微调斯托克斯光束的腰部，从而改变显微镜焦平面处的相互作用体积，从而优化SRS信号。注意：在此协议中，斯托克斯波束以1.6 MHz调制。 将基波束剩余的6 W光功率聚焦到摩擦酸锂（LBO）晶体（LBO1， θ = 90°，φ = 13.8°）上，通过产生二次谐波（SHG）使基波束变频两倍（图5A）。 为了最大限度地提高SHG效率，请稍微旋转晶体，改变φ角度（图5B）。优化 LBO1 以获得至少 2.5 W 的 SHG。 调整LBO2 的φ角度，最大限度地提高信号束的产生效率。注：镜头f1、f2和f3 的焦距经过精心选择，以将SHG光束与OPO腔体进行模式匹配。因此，这些镜头的焦距在不同的设置中会有所不同。由于OPO腔中的残余色散，腔体长度的微小变化会引起信号束频谱的偏移。 调整腔体长度以获得泵频谱，该频谱与1，040nm处的窄带斯托克斯一起，可以在1，373-5，090 cm-1范围内产生频率失谐。该范围涵盖了CH拉伸光谱区域（2，800-3，050 cm-1）中的振动。参见 图2中的蓝色光谱。 为了补偿激发显微镜物镜引起的色散效应，将宽带泵送至棱镜压缩机。将泵通过其顶点进入棱镜A，并将分散的泵引导到棱镜B的顶点，定义所需的负色散量，然后相应地设置棱镜顶端L之间的距离。注： 图6 显示了棱镜29的排列方式。在这种情况下，GDD的补偿≈-12，800 fs2;因此 L = 1.26 m。 使用布鲁斯特切割棱镜。 确保泵梁的极化位于棱镜的三角形平面内（顶部/底部未抛光面）。 确保泵束的 入射角 θ 与布鲁斯特角匹配。 确保棱镜A的出口面与棱镜B的入口面平行。 为了估计要补偿的宽带脉冲的GDD，在单个波长λ1处测量SRS信号，记录泵浦斯托克斯之间的时间延迟τ1 ，在该时间延迟获得最大SRS（λ1）。对第二个波长λ2重复此过程，再次记录SRS（λ2 ）最大值的时间延迟τ2。注意：由于GDD被定义为相对于角频率的群延迟的导数，因此上述测量值允许估计宽带波束的GDD（方程[1]）。（1） 使用λ/2波片，将泵束的极化设置为45°。将极化泵引导至长度为 13.3 mm 的 YVO4 板上，将该双折射晶体的快速轴垂直设置。注意：在通过YVO4 板时，泵脉冲将被分成两个正交极化复制副本，共线传播，但保持延迟Δt≈10 ps之间。这种延迟是双折射晶体的厚度和折射率的函数。此后，具有与斯托克斯脉冲具有相同极化状态的泵复制品将称为“信号”，而具有正交状态的泵复制品将称为“参考”。这种技术的细节，称为在线平衡检测，前面已经描述过30。 将泵和斯托克斯光束与二向色镜相结合，并使用一对荧光针孔小心地对齐它们，确保两者共线传播。衰减光束并使用透镜将其聚焦到快速（至少100 MHz带宽）光电二极管上。 阻断泵，并使用高带宽数字示波器测量单个斯托克斯脉冲。使用激光器的触发信号作为示波器测量的时钟源。确定光电二极管电压达到其最大值的平均值。 阻挡斯托克斯光束并对泵脉冲重复此过程。增加或减少泵（斯托克斯）光束的光路，直到其脉冲与斯托克斯（泵）脉冲大致同时到达。注意：这应该保证两个臂之间光路差的匹配精度最高为几毫米。 取出光电二极管，放置一个具有合适切割角的非线性晶体，以便在泵浦斯托克斯光子之间产生和频（SFG）。注意：这里使用的非线性晶体被切割用于I型相位匹配，θ = 90°，φ = 9.8°。非线性晶体的光轴应平行于斯托克斯和信号脉冲的偏振。 使泵/斯托克斯光束略微非共线性，并移动延迟线直到SFG，由于相位匹配，该信号位于泵的SHG和斯托克斯光束之间。如果未找到信号，请验证晶体上两束的空间重叠。注意：SFG是蓝移的，肉眼应该很容易看到。 如果遇到意外困难，请放置低通滤波器以移除泵和斯托克斯及其各自的SHG，并用光谱仪测量SFG（图7A）。找到SFG达到其最大强度的时间延迟，该值决定了非线性信号生成所需的理想时空重叠，并将延迟线固定在那里（图7B）。 使用经过校准的相机测量光束轮廓。或者，使用红外卡并通过眼睛估计直径。使用两个望远镜，一个用于泵，另一个用于斯托克斯光束。使用这些望远镜，尝试将光束直径与激发物镜的后孔径相匹配。注意：此过程将保证设置的最大空间分辨率。 获得SRS信号后，使用泵浦光束上的望远镜调整其直径，改变其瑞利范围，从而改变显微镜焦点处的相互作用体积。达到最大 SRS 时停止。 使用光电二极管测量泵（斯托克斯）光束的强度，并利用光电二极管的响应度计算撞击探测器有效面积的平均功率 。 如果使用高带宽光电二极管，请连接电子低通滤波器，仅获得常数或直流分量。要测量δP（f），请将高带宽光电二极管的输出（断开低通滤波器）连接到锁相放大器的输入端。将锁相输出 存储在不同的解调频率下，并使用光电二极管的响应度从V转换为W。注意：商用锁相放大器具有用于测量δP（f）的内置工具（例如，苏黎世仪器公司与 LabOne 一台 频率扫描器31）合并）。 测量光束的RIN后，关闭激光器并测量电子噪声（即，在探测器上没有任何光的情况下计算RIN）。注意：如果RIN受激光波动而不是散粒噪声的限制，则这种暗测量将有助于诊断用于测量的仪器;如果电子噪声与激光的RIN一样高，则不能用于测量激光器的RIN;可能必须使用超低噪声放大器来降低电子噪声。 如果RIN受散粒噪声而不是激光波动的限制，则将更多的光功率照射到探测器上。参见 图8。 3. 设置SRS成像的光谱检测 将泵和斯托克斯光束引导到显微镜上。 放置第1节中讨论的样品，并找到一个没有珠子的区域，以帮助对齐泵梁。使用相机，测量斯托克斯（泵）光束的反射轮廓，同时阻挡泵（斯托克斯）。在显微镜前用镜子调整激光点的位置。注意：要获得最高的 SRS 生成，它们应完全重叠。 图9 显示（A）泵，（B）斯托克斯，和（C）两束在显微镜焦平面上完全重叠。 使激发和收集物镜共聚焦。注意：使用无限远校正物镜意味着将泵聚焦在样品平面上将导致收集物镜后孔处的准直光束。 放置一个短通滤波器以去除调制的斯托克斯，并将泵束引导到光栅上。在光栅之后放置一个透镜，将分散的光束聚焦到探测器上。注意：光栅方程将有助于确定线性色散（即，在给定焦距 f32的透镜下，探测器平面上每毫米多少nm）。光栅方程涉及光栅的槽周期度 d ，入射角α，衍射角β，衍射波长λ和衍射阶 m （Eq [2]）。 （二） 对于平衡检测，测量参考的频谱和沿泵束传播的信号副本。注：光栅后泵梁的空间轮廓是一条线，由宽带泵沿其长度的不同光谱分量组成。泵浦管线的每个光谱分量将通过球面透镜聚焦在 距离f 处（参见步骤3.1-3.2）。 为避免夹住分散的泵，请将球面透镜尽可能靠近光栅。将PBS放在球面透镜之后，以分离泵复制品。注意：这里使用了偏振立方体分束器，因为这种偏振片不会扰乱泵束的偏振。它还可以有效地分离不同的泵副本，并且可以足够大以避免夹断宽带泵。PBS将反射信号复制件（s极化）并传输参考复制件（p极化）。 使用一对转向镜，引导信号并参考其各自的探测器（图1）。注：在理想的平衡配置中，信号和参考副本应具有相同的光功率。 为了消除泵浦光束中的噪声，请将测量信号的光电二极管阵列的通道与参考检波器中的对应通道相关联。因此，确保信号的第n个 光电二极管和参考光电二极管阵列测量信号和参考副本的相同光谱分量的光功率。注： 图8 显示了示例性的RIN光谱。 为保证两个光电二极管阵列之间的光谱匹配，请在光栅和PBS之间放置一个小狭缝或光圈，以对分散的泵进行空间滤波。夹紧泵复制副本除一个光谱分量之外的所有光谱分量，以将传输的光线集中在参考和信号光电二极管阵列的第n个 检测器上。使用上述转向镜调整不同检测通道的相关性。 此时，启动SRS显微镜检查。为此，请调制斯托克斯，对样本进行光栅扫描，并获取泵浦频谱（ΔI）上的调制传递及其相应的直流频谱（I），以从每个像素获得归一化SRS（ΔI/I）频谱。生成三维矩阵，其行 （x） 和列 （y） 包含样品的扫描位置。在与 x-y 平面正交的每个向量 （z） 上，存储一个 SRS 谱。注： 图12 显示了SRS高光谱数据的结构。 将斯托克斯波束的功率设置为65 mW，将宽带泵束的功率设置为20 mW。为实验设置理想的积分时间。注意：此处的积分时间为44 μs;然而，由于压电扫描仪速度较慢，像素停留时间为1 ms。 4. 高光谱SRS数据的化学计量学 使用多变量曲线分辨率分析来解开样品的不同化学成分。从 Tauler、de Juan 和 Jaumot33 中的链接下载 GUI。注意：在这里，Tauler和同事开发的多元曲线分辨率 – 交替最小二乘（MCR-ALS）MATLAB程序被使用了34，35。关于MCR-ALS对SRS数据的应用，参见 36，37;有关算法的详细讨论，请参阅 38。 在 MATLAB 中，将 SRS 高光谱数据立方体重塑为矩阵 D ，其行包含 SRS 光谱。假设未折叠的SRL超立方体 D 是浓度 C 和样品化学成分的光谱图 S 的线性组合（即 D = CS T + E，其中 E 是包含实验误差的矩阵，上标 T 表示矩阵转置）。 获取数据的主要成分，以分离 C 和 S。众所周知，第1节中讨论的样本包含四个物种，即DMSO，橄榄油，PMMA和PS，因此将程序配置为搜索四个物种和另一个物种以解释背景噪音。如果存在具有较高或较低物种数的不同样品，请相应地配置程序。注意：该程序对光谱数据进行奇异值分解，使用它们作为纯光谱 S的初始猜测。 或者，用包含已知光谱迹线（例如，物质的自发拉曼光谱）的基质馈送程序。注意：使用纯光谱的初始估计，程序将计算 C = DS（STS）−1 和 ST = （CTC）−1CTD。 C 和 S 的新值使用交替最小二乘算法进行优化。 由于 SRS 是非负信号，因此请约束交替最小二乘算法以提供正值。注意：优化的 C 和 S 将允许构造一个新的矩阵 D*= CST，这是一个程序将与原始数据 D 进行比较的数据集。程序会自动迭代这些步骤，直到 D* 和 D 之间的差值小于可以定义的任意阈值。 图 C 和 S 以获取化学图像和样品化学成分的特征光谱。