JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Imunologia e Infecção

Oral kombinasjons antiretroviral behandling i HIV-1-infiserte humaniserte mus

Published: October 06, 2022
doi:
10.3791/63696
, , , , , ,
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine,University of California, Los Angeles

Summary

Denne protokollen beskriver en ny metode for å levere orale kombinasjons-antiretrovirale legemidler som vellykket undertrykker HIV-1 RNA-replikasjon hos humaniserte mus.

Abstract

Humant immunsviktvirus (HIV-1) -pandemien fortsetter å spre seg med uforminsket styrke over hele verden, og for tiden er det ingen vaksine tilgjengelig mot HIV. Selv om kombinert antiretroviral terapi (cART) har vært vellykket i å undertrykke viral replikasjon, kan det ikke helt utrydde reservoaret fra HIV-infiserte individer. En sikker og effektiv kurstrategi for HIV-infeksjon vil kreve multipronged metoder, og derfor er fremskrittene av dyremodeller for HIV-1-infeksjon avgjørende for utviklingen av HIV-kurforskning. Humaniserte mus rekapitulerer viktige trekk ved HIV-1-infeksjon. Den humaniserte musemodellen kan infiseres av HIV-1 og viral replikasjon kan kontrolleres med cART-regimer. Videre resulterer cART-avbrudd i en rask viral rebound hos humaniserte mus. Administrering av cART til dyret kan imidlertid være ineffektivt, vanskelig eller giftig, og mange klinisk relevante cART-regimer kan ikke utnyttes optimalt. Sammen med å være potensielt usikre for forskere, induserer administrering av cART ved en vanlig intensiv daglig injeksjonsprosedyre stress ved fysisk begrensning av dyret. Den nye orale cART-metoden for å behandle HIV-1-infiserte humaniserte mus beskrevet i denne artikkelen resulterte i undertrykkelse av viremi under deteksjonsnivået, økt grad av CD4 + restaurering og forbedret generell helse hos HIV-1-infiserte humaniserte mus.

Introduction

Forventet levetid for kronisk humant immunsviktvirus (HIV)-infiserte individer er betydelig forbedret med kombinasjons-antiretroviral behandling (cART)1,2. cART reduserer vellykket HIV-1-replikasjonen og øker CD4 + T-celletallet til normalitet hos flertallet av HIV-1 kronisk infiserte deltakere3, noe som resulterer i forbedret generell helse og dramatisk redusert sykdomsprogresjon4. Det latente HIV-1-reservoaret etableres imidlertid selv når ART initieres ved akutt infeksjon 5,6,7. Reservoarer vedvarer over år under ART og rask viral rebound etter ART-avbrudd er godt dokumentert 8,9. Personer som lever med HIV på ART er også disponert for en høyere risiko for comorbiditeter som kardiovaskulær sykdom, kreft og nevroforstyrrelser10,11,12. Derfor er det nødvendig med en funksjonell kur for HIV. Dyremodeller for HIV-1-infeksjon gir åpenbare fordeler ved å utvikle og validere nye HIV-kurstrategier13,14,15. Humaniserte mus, som en liten dyremodell, kan gi multilineage human immuncelle rekonstituering i forskjellige vev, noe som gjør det mulig å studere HIV-infeksjon16,17,18,19. Blant humaniserte modeller rekapitulerer den humaniserte benmarg-lever-tymus (BLT) -modellen vellykket kronisk HIV-1-infeksjon samt funksjonelle humane immunresponser mot HIV-1-infeksjon 20,21,22,23,24. Derfor har den humaniserte BLT-musemodellen blitt mye brukt til å undersøke ulike aspekter i HIV-forskningsfeltet. Humaniserte BLT-mus er ikke bare veletablerte modeller for rekapitulering av vedvarende HIV-1-infeksjon og patogenese, men også konsekvensverktøy for evaluering av celleterapibaserte intervensjonsstrategier. De nåværende forfatterne og andre har vist at den humaniserte BLT-musemodellen rekapitulerer vedvarende HIV-1-infeksjon og patogenese 25,26,27 og gir verktøy for å evaluere celleterapibaserte intervensjonsstrategier 28,29,30,31,32,33.

cART-regimer som består av kombinasjoner av antiretrovirale legemidler som tas daglig, undertrykker HIV-1-replikasjon til det punktet at virusbelastningen hos vellykkede behandlede individer forblir uoppdagelig på lang sikt34. Resultatene av behandling av HIV-infiserte humaniserte mus med klinisk relevante cART-regimer ligner de som er observert hos HIV-1-infiserte ART-behandlede individer22: HIV-1-nivåer undertrykkes under grensene for deteksjon og avbrudd av cART-resultater i en rebound av HIV-replikasjon fra det latente reservoaret35. Subkutan (SC)27,36,37 eller intraperitoneal (IP)37,38,39 injeksjon er ruten som vanligvis brukes til cART-behandling hos humaniserte mus. Imidlertid induserer intensiv daglig injeksjon stress til dyr ved fysisk tilbakeholdenhet40. Det er også arbeidskrevende og potensielt usikkert for forskere på grunn av økt eksponering for HIV mens du bruker skarpe stoffer. Oral administrering er ideell for å etterligne absorpsjon, distribusjon og utskillelse av cART-legemidler som tas av HIV-1-infiserte personer. Oral administrering innebærer vanligvis tilpassede og ofte arbeidskrevende prosedyrer for å sette de antiretrovirale legemidlene i sterilisert (nødvendig på grunn av immundefekt hos musene) mat 24,37,41 eller vann 42,43,44,45,46 , som kan eller ikke kan være kjemisk kompatibel med mange antiretrovirale legemidler, eller resultere i noe musene ikke lett vil spise eller drikke (noe som vil påvirke dose og legemiddelnivåer i kroppen). Den nye perorale cART-administrasjonsmetoden som foreslås her, overgår tidligere leveringsforsøk på grunn av dens kompatibilitet med forskjellige typer antiretrovirale legemidler, sikkerhet og enkel forberedelse og administrasjon, og reduksjon av dyrs stress og angst som følge av den daglige injeksjonen.

Tenofovirdisoproksilfumarat (TDF), Elvitegravir (ELV) og Raltegravir (RAL) er dårlig vannløselige legemidler. Interessant nok observeres økt biotilgjengelighet av TDF med fettstoffer, noe som tyder på at konkurransedyktig inhibering av lipaser av fet mat kan gi viss beskyttelse for TDF47. Derfor ble DietGel Boost-kopper valgt for å erstatte vanlig gnager chow som leveringsmetode basert på deres beskjedne fettinnhold (20,3 g per 100 g) sammenlignet med vanlig gnager chow (10 g per 100 g) og et typisk mus fettfattig kosthold (40-60 g per 100 g) 48. Den totale vekten av en kopp er 75 g; Dermed vil hver kopp inneholde mengden mat, og derfor stoff, tilstrekkelig for fem mus over 3 dager.

Protocol

Anonymisert humant fostervev ble ervervet kommersielt. Dyreforsøk ble utført i henhold til protokoller godkjent av University of California, Los Angeles og (UCLA) Animal Research Committee (ARC) i samsvar med alle føderale, statlige og lokale retningslinjer. Spesielt ble alle forsøkene utført i samsvar med anbefalingene og retningslinjene for bolig og stell av laboratoriedyr fra National Institutes of Health (NIH) og Association for Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care (AALAC) International under U…

Representative Results

Forutsatt at en gjennomsnittlig mus som veier 25 g bruker 4 g mat per dag, tilsvarer den daglige legemiddeldosen gjennom oral inntak 2,88 mg / kg TFV, 83 mg / kg FTC og 768 mg / kg RAL. For å teste om det optimaliserte matregimet er giftig og påvirker den generelle helsen sammenlignet med daglig injeksjon av cART, ble musens vekt overvåket ukentlig før og under cART gjennom oral eller subkutan injeksjon. Det var ingen signifikante vektforskjeller før administrering av cART i hver gruppe (figur 1…

Discussion

En oral cART-administrasjonsmetode er utviklet her for HIV-1-infiserte humaniserte mus ved å kombinere tre antiretrovirale legemidler innen næringsrik mat. Sammenlignet med administrasjon ved daglige injeksjoner, er oral levering enklere å bruke, begrenser administrasjonsfrekvensen, reduserer dyrehåndtering, minimerer stress og forbedrer sikkerheten55. Frem til dette punktet har bare noen få studier på humaniserte mus 24,37,41 brukt matpellets som inneholder knuste ART-stoffer for å behandl…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gjerne takke Dr. Romas Geleziunas og Jeff Murry og folket på Gilead for å gi de antiretrovirale legemidlene som brukes i denne studien. Dette arbeidet ble finansiert av NCI 1R01CA239261-01 (til Kitchen), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core og Humanized Mouse Core), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (til Zhen), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Dette arbeidet ble også støttet av UCLA AIDS Institute, James B. Pendleton Charitable Trust og McCarthy Family Foundation.

Materials

60 mm petri dish Thermo Scientific Nunc 150288 For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 Antibody Biolegend 344722 For flow cytometry
BD LSRFortessa BD biosciences For flow data collection
CD34 microbeads Miltenyi Biotec 130-046-702 For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubes Falcon 14-432-22 For dissolving ART
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 For making ART food
Elvitegravir Gilead Gifted from Gilead
Emtricitabine Gilead Gifted from Gilead
FITC anti-human CD3 Antibody Biolegend 317306 For flow cytometry
Flowjo software FlowJo For flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		 IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
Human fetal tissue Advanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45 Biolegend 304022 For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 Antibody Biolegend 300528 For flow cytometry
QIAamp Viral RNA Kits Qiagen  52904 For measuring viral load
Raltegravir Merck Gifted from Merck
Sterile cell scrapers Thermo Scientific 179693 For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653 For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarate Gilead Gifted from Gilead
Trimethoprim-Sulfamethoxazole Pharmaceutical Associates NDC 0121-0854-16 For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Antiretroviral Therapy Cohort Collaboration. Life expectancy of individuals on combination antiretroviral therapy in high-income countries: a collaborative analysis of 14 cohort studies. Lancet. 372 (9635), 293-299 (2008).
  2. May, M. T., et al. Impact on life expectancy of HIV-1 positive individuals of CD4+ cell count and viral load response to antiretroviral therapy. AIDS. 28 (8), 1193-1202 (2014).
  3. Autran, B., et al. Positive effects of combined antiretroviral therapy on CD4+ T cell homeostasis and function in advanced HIV disease. Science. 277 (5322), 112-116 (1997).
  4. Palella, F. J., et al. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV outpatient study investigators. The New England Journal of Medicine. 338 (13), 853-860 (1998).
  5. Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
  6. Ananworanich, J., Dube, K., Chomont, N. How does the timing of antiretroviral therapy initiation in acute infection affect HIV reservoirs. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (1), 18-28 (2015).
  7. Whitney, J. B., et al. Rapid seeding of the viral reservoir prior to SIV viraemia in rhesus monkeys. Nature. 512 (7512), 74-77 (2014).
  8. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4 T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  9. Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature Immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  10. Brothers, T. D., et al. Frailty in people aging with human immunodeficiency virus (HIV) infection. Journal of Infectious Disease. 210 (8), 1170-1179 (2014).
  11. D. A. D. Study Group. Use of nucleoside reverse transcriptase inhibitors and risk of myocardial infarction in HIV-infected patients enrolled in the D:A:D study: a multi-cohort collaboration. Lancet. 371 (9622), 1417-1426 (2008).
  12. Schouten, J., et al. Cross-sectional comparison of the prevalence of age-associated comorbidities and their risk factors between HIV-infected and uninfected individuals: the AGEhIV cohort study. Clinical Infectious Diseases. 59 (12), 1787-1797 (2014).
  13. Policicchio, B. B., Pandrea, I., Apetrei, C. Animal models for HIV cure research. Frontiers in Immunology. 7, 12 (2016).
  14. Hessell, A. J., Haigwood, N. L. Animal models in HIV-1 protection and therapy. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (3), 170-176 (2015).
  15. Ambrose, Z., KewalRamani, V. N., Bieniasz, P. D., Hatziioannou, T. HIV/AIDS: in search of an animal model. Trends in Biotechnology. 25 (8), 333-337 (2007).
  16. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature Medicine. 12 (11), 1316 (2006).
  17. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  18. Wege, A. K., Melkus, M. W., Denton, P. W., Estes, J. D., Garcia, J. V. Functional and phenotypic characterization of the humanized BLT mouse model. Current Topics in Microbiology and Immunology. 324, 149-165 (2008).
  19. Garcia, J. V. In vivo platforms for analysis of HIV persistence and eradication. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 424-431 (2016).
  20. Carrillo, M. A., Zhen, A., Kitchen, S. G. The use of the humanized mouse model in gene therapy and immunotherapy for HIV and cancer. Frontiers in Immunology. 9, 746 (2018).
  21. Abeynaike, S., Paust, S. Humanized mice for the evaluation of novel HIV-1 therapies. Frontiers in Immunology. 12, 636775 (2021).
  22. Marsden, M. D., Zack, J. A. Humanized mouse models for human immunodeficiency virus infection. Annual Review of Virology. 4 (1), 393-412 (2017).
  23. Brainard, D. M., et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
  24. Nischang, M., et al. Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection: a novel concept using long-acting anti-retroviral drugs for treating HIV-1. PLoS One. 7 (6), 38853 (2012).
  25. Garcia-Beltran, W. F., et al. Innate immune reconstitution in humanized bone marrow-liver-thymus (HuBLT) mice governs adaptive cellular immune function and responses to HIV-1 infection. Frontiers in Immunology. 12, 667393 (2021).
  26. Cheng, L., et al. Blocking type I interferon signaling enhances T cell recovery and reduces HIV-1 reservoirs. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 269-279 (2017).
  27. Zhen, A., et al. Targeting type I interferon-mediated activation restores immune function in chronic HIV infection. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 260-268 (2017).
  28. Khamaikawin, W., et al. Modeling anti-HIV-1 HSPC-based gene therapy in humanized mice previously infected with HIV-1. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 23-32 (2018).
  29. Kitchen, S. G., et al. Engineering antigen-specific T cells from genetically modified human hematopoietic stem cells in immunodeficient mice. PLoS One. 4 (12), 8208 (2009).
  30. Zhen, A., et al. Robust CAR-T memory formation and function via hematopoietic stem cell delivery. PLoS Pathogens. 17 (4), 1009404 (2021).
  31. Zhen, A., et al. HIV-specific immunity derived from chimeric antigen receptor-engineered stem cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  32. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2013).
  33. Mu, W., Carrillo, M. A., Kitchen, S. G. Engineering CAR T cells to target the hiv reservoir. Frontiers in Celluar and Infection Microbiology. 10, 410 (2020).
  34. Arts, E. J., Hazuda, D. J. HIV-1 antiretroviral drug therapy. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 2 (4), 007161 (2012).
  35. Denton, P. W., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  36. Kovarova, M., et al. A long-acting formulation of the integrase inhibitor raltegravir protects humanized BLT mice from repeated high-dose vaginal HIV challenges. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (6), 1586-1596 (2016).
  37. Lavender, K. J., et al. An advanced BLT-humanized mouse model for extended HIV-1 cure studies. AIDS. 32 (1), 1-10 (2018).
  38. Denton, P. W., et al. Targeted cytotoxic therapy kills persisting HIV infected cells during ART. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003872 (2014).
  39. Marsden, M. D., et al. In vivo activation of latent HIV with a synthetic bryostatin analog effects both latent cell "kick" and "kill" in strategy for virus eradication. PLoS Pathogens. 13 (9), 1006575 (2017).
  40. Stuart, S. A., Robinson, E. S. Reducing the stress of drug administration: implications for the 3Rs. Science Report. 5, 14288 (2015).
  41. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  42. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics reduce systemic and gut inflammation in chronic treated HIV. PLoS Pathogens. 18 (1), 1010160 (2022).
  43. Mu, W., et al. Apolipoprotein A-I mimetics attenuate macrophage activation in chronic treated HIV. AIDS. 35 (4), 543-553 (2021).
  44. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics favorably impact cyclooxygenase 2 and bioactive lipids that may contribute to cardiometabolic syndrome in chronic treated HIV. Metabolism. 124, 154888 (2021).
  45. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational antiretroviral therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
  46. Llewellyn, G. N., et al. Humanized mouse model of HIV-1 latency with enrichment of latent virus in PD-1(+) and TIGIT(+) CD4 T cells. Journal of Virology. 93 (10), 02086 (2019).
  47. Kearney, B. P., Flaherty, J. F., Shah, J. Tenofovir disoproxil fumarate: clinical pharmacology and pharmacokinetics. Clinical Pharmacokinetics. 43 (9), 595-612 (2004).
  48. Speakman, J. R. Use of high-fat diets to study rodent obesity as a model of human obesity. International Journal of Obesity (Lond). 43 (8), 1491-1492 (2019).
  49. Zhen, A., et al. Stem-cell based engineered immunity against HIV infection in the humanized mouse model. Journal of Visualized Experiments. (113), e54048 (2016).
  50. Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270 (2016).
  51. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
  52. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  53. Shimizu, S., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  54. Ladinsky, M. S., et al. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. Elife. 8, 46916 (2019).
  55. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  56. Lamorde, M., et al. Effect of food on the steady-state pharmacokinetics of tenofovir and emtricitabine plus efavirenz in Ugandan adults. AIDS Research and Treatment. 2012, 105980 (2012).
  57. Watkins, M. E., et al. Development of a novel formulation that improves preclinical bioavailability of tenofovir disoproxil fumarate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 906-919 (2017).
  58. Moccia, K. D., Olsen, C. H., Mitchell, J. M., Landauer, M. R. Evaluation of hydration and nutritional gels as supportive care after total-body irradiation in mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (3), 323-328 (2010).
  59. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  60. Santos, N. C., Figueira-Coelho, J., Martins-Silva, J., Saldanha, C. Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and molecular aspects. Biochemical Pharmacology. 65 (7), 1035-1041 (2003).
  61. Kolb, K. H., Jaenicke, G., Kramer, M., Schulze, P. E. Absorption, distribution and elimination of labeled dimethyl sulfoxide in man and animals. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 85-95 (1967).
  62. Yellowlees, P., Greenfield, C., McIntyre, N. Dimethylsulphoxide-incuded toxicity. Lancet. 2 (8202), 1004-1006 (1980).
  63. Swanson, B. N. Medical use of dimethyl sulfoxide (DMSO). Reviews in Clinical & Basic Pharmacology. 5 (1-2), 1-33 (1985).

Tags

Keywords: Oral Antiretroviral TreatmentHIV-1Humanized MiceCARTFTCTDFRALELVDMSOTrimethoprim SulfamethoxazoleDrug DeliveryPreclinical StudiesHIV Cure
check_url/pt/63696?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A., Rezek, V., Martin, H., Lizarraga, M., Kitchen, S. Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice. J. Vis. Exp. (188), e63696, doi:10.3791/63696 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image