טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב דרך הפה בעכברים נגועים ב- HIV-1
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה חדשנית להעברת תרופות אנטי-רטרו-ויראליות משולבות דרך הפה המדכאות בהצלחה שכפול RNA של HIV-1 בעכברים אנושיים.
Abstract
מגפת נגיף הכשל החיסוני האנושי (HIV-1) ממשיכה להתפשט ללא הפרעה ברחבי העולם, ונכון לעכשיו, אין חיסון זמין נגד HIV. למרות שטיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב (cART) הצליח לדכא שכפול נגיפי, הוא אינו יכול למגר לחלוטין את המאגר מאנשים נגועים ב- HIV. אסטרטגיית ריפוי בטוחה ויעילה להידבקות ב- HIV תדרוש שיטות רב-תכליתיות, ולכן ההתקדמות של מודלים חייתיים לזיהום ב- HIV-1 הם מרכזיים לפיתוח מחקר ריפוי HIV. עכברים אנושיים משחזרים תכונות מרכזיות של הידבקות ב- HIV-1. מודל העכבר האנושי יכול להיות נגוע ב- HIV-1 וניתן לשלוט בשכפול הנגיף באמצעות משטרי cART. יתר על כן, הפרעה ל-cART גורמת לריבאונד נגיפי מהיר בעכברים אנושיים. עם זאת, מתן cART לבעל החיים יכול להיות לא יעיל, קשה או רעיל, ומשטרי cART רלוונטיים רבים מבחינה קלינית אינם ניתנים לניצול מיטבי. לצד היותו עלול להיות לא בטוח עבור חוקרים, מתן cART על ידי הליך הזרקה יומי אינטנסיבי נפוץ גורם ללחץ על ידי ריסון פיזי של החיה. שיטת cART האוראלית החדשנית לטיפול בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1 המתוארת במאמר זה הביאה לדיכוי של וירמיה מתחת לרמת הזיהוי, לשיעור מוגבר של שחזור CD4+ ולשיפור הבריאות הכללית בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV-1.
Introduction
תוחלת החיים של אנשים הנגועים בנגיף הכשל החיסוני האנושי הכרוני (HIV) השתפרה באופן משמעותי עם טיפול אנטי-רטרו-ויראלי משולב (cART)1,2. cART מפחית בהצלחה את שכפול ה- HIV-1 ומגדיל את ספירת תאי ה- CD4+ T לנורמליות אצל רוב המשתתפים הנגועים ב- HIV-1 באופן כרוני3, וכתוצאה מכך בריאות כללית משופרת והפחתה דרמטית בהתקדמות המחלה4. עם זאת, מאגר HIV-1 סמוי נוצר גם כאשר ART הוא יזם במהלך זיהום חריף 5,6,7. המאגרים נמשכים לאורך שנים במהלך ART וריבאונד נגיפי מהיר לאחר שהפרעת ART מתועדת היטב 8,9. אנשים החיים עם HIV על ART הם גם נטייה לסיכון גבוה יותר של תחלואה נלווית כגון מחלות לב וכלי דם, סרטן, והפרעות נוירו10,11,12. לכן, יש צורך בתרופה פונקציונלית ל- HIV. מודלים של בעלי חיים לזיהום ב- HIV-1 מציעים יתרונות ברורים בפיתוח ואימות אסטרטגיות ריפוי HIV חדשניות13,14,15. עכברים אנושיים, כמודל של חיה קטנה, יכולים לספק שחזור תאי חיסון אנושיים רב-שכבתיים ברקמות שונות, מה שמאפשר מחקר מקרוב של הידבקות ב- HIV16,17,18,19. מבין המודלים האנושיים, המודל האנושי של מח עצם-כבד-תימוס (BLT) משחזר בהצלחה זיהום כרוני ב-HIV-1, כמו גם תגובות חיסוניות אנושיות פונקציונליות לזיהום ב-HIV-1 20,21,22,23,24. לכן, מודל עכבר BLT האנושי נמצא בשימוש נרחב כדי לחקור היבטים שונים בתחום המחקר של HIV. עכברי BLT אנושיים הם לא רק מודלים מבוססים היטב לסיכום של זיהום מתמשך ב- HIV-1 ופתוגנזה, אלא גם כלים תוצאתיים להערכת אסטרטגיות התערבות מבוססות טיפול בתאים. המחברים הנוכחיים ואחרים הראו כי מודל עכברי BLT האנושיים משחזר זיהום מתמשך ב- HIV-1 ופתוגנזה 25,26,27 ומספק כלים להערכת אסטרטגיות התערבות מבוססות טיפול תאי 28,29,30,31,32,33.
משטרי cART המורכבים משילובים של תרופות אנטי-רטרו-ויראליות הנלקחות מדי יום מדכאות שכפול HIV-1 עד כדי כך שהעומס הנגיפי אצל אנשים שטופלו בהצלחה נותר בלתי ניתן לגילוי לאורךזמן 34. התוצאות של טיפול בעכברים אנושיים נגועים ב- HIV עם משטרי cART רלוונטיים מבחינה קלינית דומות לאלה שנצפו אצל אנשים נגועים ב- HIV-1 שטופלו ב- ART22: רמות HIV-1 מדוכאות מתחת לגבולות הגילוי וההפרעה של cART גורמת לריבאונד של שכפול HIV מהמאגר הסמוי35. הזרקה תת-עורית (SC)27,36,37 או תוך-צפקית (IP)37,38,39 היא המסלול המשמש בדרך כלל לטיפול ב-cART בעכברים אנושיים. עם זאת, הזרקה יומית אינטנסיבית גורמת ללחץ על בעלי חיים על ידי ריסון פיזי40. היא גם דורשת עבודה רבה ועלולה להיות לא בטוחה לחוקרים בשל חשיפה מוגברת ל-HIV תוך שימוש בחדים. מתן אוראלי הוא אידיאלי כדי לחקות את הספיגה, ההפצה וההפרשה של תרופות cART כי הם נלקחים על ידי אנשים נגועים ב- HIV-1. מתן אוראלי כולל בדרך כלל הליכים מותאמים אישית ולעתים קרובות מייגעים כדי לשים את התרופות antiretroviral מעוקר (הכרחי בשל הכשל החיסוני של העכברים) מזון 24,37,41 או מים 42,43,44,45,46 אשר עשוי או לא יכול להיות תואם כימית עם תרופות אנטי-רטרו-ויראליות רבות, או לגרום למשהו שהעכברים לא יאכלו או ישתו בקלות (מה שישפיע על רמות המינון והתרופות בגוף)., שיטת ניהול ה- cART הפרולית החדשנית המוצעת כאן עולה על ניסיונות אספקה קודמים בשל תאימותה לסוגים שונים של תרופות אנטי-רטרו-ויראליות, בטיחות וקלות הכנה וניהולם, והפחתת מתח וחרדה של בעלי חיים הנובעים מההזרקה היומית.
Tenofovir disoproxil fumarate (TDF), Elvitegravir (ELV) ו- Raltegravir (RAL) הן תרופות מסיסות במים. באופן מעניין, הזמינות הביולוגית המוגברת של TDF נצפתה עם מזונות שומניים, מה שמרמז על כך שעיכוב תחרותי של ליפאזות על ידי מזון שומני עשוי לספק הגנה מסוימת ל-TDF47. לכן, כוסות DietGel Boost נבחרו להחליף צ’או מכרסם רגיל כשיטת אספקה המבוססת על תכולת השומן הצנועה שלהן (20.3 גרם ל-100 גרם) בהשוואה לצ’או מכרסמים רגיל (10 גרם ל-100 גרם) ודיאטה טיפוסית עתירת שומן של עכברים (40-60 גרם ל-100 גרם)48. המשקל הכולל של אחת הוא 75 גרם; לפיכך, כל תכיל את כמות המזון, ולכן תרופות, מספיק עבור 5 עכברים במשך 3 ימים.
Protocol
Representative Results
Discussion
שיטת מתן cART דרך הפה מפותחת כאן עבור עכברים נגועים ב- HIV-1 על ידי שילוב של שלוש תרופות אנטי-רטרו-ויראליות בתוך מזון עשיר בחומרים מזינים. בהשוואה למתן על ידי זריקות יומיות, משלוח דרך הפה קל יותר לשימוש, מגביל את תדירות הניהול, מפחית את הטיפול בבעלי חיים, ממזער מתח ומשפר את הבטיחות55. …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לד”ר רומאס גלזיונאס ולג’ף מורי ולאנשים בגיליאד על אספקת התרופות האנטי-רטרו-ויראליות ששימשו במחקר זה. עבודה זו מומנה על ידי NCI 1R01CA239261-01 (למטבח), מענקי NIH P30AI28697 (ליבת הווירולוגיה של UCLA CFAR, ליבת הטיפול בגנים ותאים, וליבת עכבר אנושית), U19AI149504 (PIs: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (לג’ן), NIAID R2120200174 (PIs: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (קאריו). עבודה זו נתמכה גם על ידי מכון האיידס של UCLA, קרן הצדקה על שם ג’יימס ב. פנדלטון וקרן משפחת מקארתי.
Materials
| 60 mm petri dish | Thermo Scientific Nunc | 150288 | For aliquoting ART food |
| APC anti-human CD8 Antibody | Biolegend | 344722 | For flow cytometry |
| BD LSRFortessa | BD biosciences | For flow data collection | |
| CD34 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-046-702 | For NSG-BLT mice generation |
| Centrifuge tubes | Falcon | 14-432-22 | For dissolving ART |
| DietGel Boost | ClearH2O | 72-04-5022 | For making ART food |
| Elvitegravir | Gilead | Gifted from Gilead | |
| Emtricitabine | Gilead | Gifted from Gilead | |
| FITC anti-human CD3 Antibody | Biolegend | 317306 | For flow cytometry |
| Flowjo software | FlowJo | For flow cytometry data analysis | |
| HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; | IDT | Customized | For viral load RT-PCR |
| HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT TAACTG [Tamra-Q]-3′; |
IDT | Customized | For viral load RT-PCR |
| HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; | IDT | Customized | For viral load RT-PCR |
| Human fetal tissue | Advanced Bioscience Resources, Inc | ||
| Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ | The Jackson Laboratory | 5557 | For constructing the humanized mice |
| Pacific Blue anti-human CD45 | Biolegend | 304022 | For flow cytometry |
| PerCP anti-human CD4 Antibody | Biolegend | 300528 | For flow cytometry |
| QIAamp Viral RNA Kits | Qiagen | 52904 | For measuring viral load |
| Raltegravir | Merck | Gifted from Merck | |
| Sterile cell scrapers | Thermo Scientific | 179693 | For aliquoting ART food |
| TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit | Applied Biosystems | 4392653 | For plasma viral load detection |
| Tenofovir disoproxil fumarate | Gilead | Gifted from Gilead | |
| Trimethoprim-Sulfamethoxazole | Pharmaceutical Associates | NDC 0121-0854-16 | For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains 200 mg Sulfamethoxazole, USP 40 mg Trimethoprim, USP NMT 0.5% Alcohol |
Referências
- Antiretroviral Therapy Cohort Collaboration. Life expectancy of individuals on combination antiretroviral therapy in high-income countries: a collaborative analysis of 14 cohort studies. Lancet. 372 (9635), 293-299 (2008).
- May, M. T., et al. Impact on life expectancy of HIV-1 positive individuals of CD4+ cell count and viral load response to antiretroviral therapy. AIDS. 28 (8), 1193-1202 (2014).
- Autran, B., et al. Positive effects of combined antiretroviral therapy on CD4+ T cell homeostasis and function in advanced HIV disease. Science. 277 (5322), 112-116 (1997).
- Palella, F. J., et al. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV outpatient study investigators. The New England Journal of Medicine. 338 (13), 853-860 (1998).
- Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
- Ananworanich, J., Dube, K., Chomont, N. How does the timing of antiretroviral therapy initiation in acute infection affect HIV reservoirs. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (1), 18-28 (2015).
- Whitney, J. B., et al. Rapid seeding of the viral reservoir prior to SIV viraemia in rhesus monkeys. Nature. 512 (7512), 74-77 (2014).
- Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4 T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
- Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature Immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
- Brothers, T. D., et al. Frailty in people aging with human immunodeficiency virus (HIV) infection. Journal of Infectious Disease. 210 (8), 1170-1179 (2014).
- D. A. D. Study Group. Use of nucleoside reverse transcriptase inhibitors and risk of myocardial infarction in HIV-infected patients enrolled in the D:A:D study: a multi-cohort collaboration. Lancet. 371 (9622), 1417-1426 (2008).
- Schouten, J., et al. Cross-sectional comparison of the prevalence of age-associated comorbidities and their risk factors between HIV-infected and uninfected individuals: the AGEhIV cohort study. Clinical Infectious Diseases. 59 (12), 1787-1797 (2014).
- Policicchio, B. B., Pandrea, I., Apetrei, C. Animal models for HIV cure research. Frontiers in Immunology. 7, 12 (2016).
- Hessell, A. J., Haigwood, N. L. Animal models in HIV-1 protection and therapy. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (3), 170-176 (2015).
- Ambrose, Z., KewalRamani, V. N., Bieniasz, P. D., Hatziioannou, T. HIV/AIDS: in search of an animal model. Trends in Biotechnology. 25 (8), 333-337 (2007).
- Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature Medicine. 12 (11), 1316 (2006).
- Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
- Wege, A. K., Melkus, M. W., Denton, P. W., Estes, J. D., Garcia, J. V. Functional and phenotypic characterization of the humanized BLT mouse model. Current Topics in Microbiology and Immunology. 324, 149-165 (2008).
- Garcia, J. V. In vivo platforms for analysis of HIV persistence and eradication. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 424-431 (2016).
- Carrillo, M. A., Zhen, A., Kitchen, S. G. The use of the humanized mouse model in gene therapy and immunotherapy for HIV and cancer. Frontiers in Immunology. 9, 746 (2018).
- Abeynaike, S., Paust, S. Humanized mice for the evaluation of novel HIV-1 therapies. Frontiers in Immunology. 12, 636775 (2021).
- Marsden, M. D., Zack, J. A. Humanized mouse models for human immunodeficiency virus infection. Annual Review of Virology. 4 (1), 393-412 (2017).
- Brainard, D. M., et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
- Nischang, M., et al. Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection: a novel concept using long-acting anti-retroviral drugs for treating HIV-1. PLoS One. 7 (6), 38853 (2012).
- Garcia-Beltran, W. F., et al. Innate immune reconstitution in humanized bone marrow-liver-thymus (HuBLT) mice governs adaptive cellular immune function and responses to HIV-1 infection. Frontiers in Immunology. 12, 667393 (2021).
- Cheng, L., et al. Blocking type I interferon signaling enhances T cell recovery and reduces HIV-1 reservoirs. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 269-279 (2017).
- Zhen, A., et al. Targeting type I interferon-mediated activation restores immune function in chronic HIV infection. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 260-268 (2017).
- Khamaikawin, W., et al. Modeling anti-HIV-1 HSPC-based gene therapy in humanized mice previously infected with HIV-1. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 23-32 (2018).
- Kitchen, S. G., et al. Engineering antigen-specific T cells from genetically modified human hematopoietic stem cells in immunodeficient mice. PLoS One. 4 (12), 8208 (2009).
- Zhen, A., et al. Robust CAR-T memory formation and function via hematopoietic stem cell delivery. PLoS Pathogens. 17 (4), 1009404 (2021).
- Zhen, A., et al. HIV-specific immunity derived from chimeric antigen receptor-engineered stem cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
- Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2013).
- Mu, W., Carrillo, M. A., Kitchen, S. G. Engineering CAR T cells to target the hiv reservoir. Frontiers in Celluar and Infection Microbiology. 10, 410 (2020).
- Arts, E. J., Hazuda, D. J. HIV-1 antiretroviral drug therapy. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 2 (4), 007161 (2012).
- Denton, P. W., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
- Kovarova, M., et al. A long-acting formulation of the integrase inhibitor raltegravir protects humanized BLT mice from repeated high-dose vaginal HIV challenges. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (6), 1586-1596 (2016).
- Lavender, K. J., et al. An advanced BLT-humanized mouse model for extended HIV-1 cure studies. AIDS. 32 (1), 1-10 (2018).
- Denton, P. W., et al. Targeted cytotoxic therapy kills persisting HIV infected cells during ART. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003872 (2014).
- Marsden, M. D., et al. In vivo activation of latent HIV with a synthetic bryostatin analog effects both latent cell "kick" and "kill" in strategy for virus eradication. PLoS Pathogens. 13 (9), 1006575 (2017).
- Stuart, S. A., Robinson, E. S. Reducing the stress of drug administration: implications for the 3Rs. Science Report. 5, 14288 (2015).
- Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
- Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics reduce systemic and gut inflammation in chronic treated HIV. PLoS Pathogens. 18 (1), 1010160 (2022).
- Mu, W., et al. Apolipoprotein A-I mimetics attenuate macrophage activation in chronic treated HIV. AIDS. 35 (4), 543-553 (2021).
- Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics favorably impact cyclooxygenase 2 and bioactive lipids that may contribute to cardiometabolic syndrome in chronic treated HIV. Metabolism. 124, 154888 (2021).
- Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational antiretroviral therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
- Llewellyn, G. N., et al. Humanized mouse model of HIV-1 latency with enrichment of latent virus in PD-1(+) and TIGIT(+) CD4 T cells. Journal of Virology. 93 (10), 02086 (2019).
- Kearney, B. P., Flaherty, J. F., Shah, J. Tenofovir disoproxil fumarate: clinical pharmacology and pharmacokinetics. Clinical Pharmacokinetics. 43 (9), 595-612 (2004).
- Speakman, J. R. Use of high-fat diets to study rodent obesity as a model of human obesity. International Journal of Obesity (Lond). 43 (8), 1491-1492 (2019).
- Zhen, A., et al. Stem-cell based engineered immunity against HIV infection in the humanized mouse model. Journal of Visualized Experiments. (113), e54048 (2016).
- Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270 (2016).
- Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
- Shimizu, S., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
- Ladinsky, M. S., et al. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. Elife. 8, 46916 (2019).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
- Lamorde, M., et al. Effect of food on the steady-state pharmacokinetics of tenofovir and emtricitabine plus efavirenz in Ugandan adults. AIDS Research and Treatment. 2012, 105980 (2012).
- Watkins, M. E., et al. Development of a novel formulation that improves preclinical bioavailability of tenofovir disoproxil fumarate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 906-919 (2017).
- Moccia, K. D., Olsen, C. H., Mitchell, J. M., Landauer, M. R. Evaluation of hydration and nutritional gels as supportive care after total-body irradiation in mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (3), 323-328 (2010).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
- Santos, N. C., Figueira-Coelho, J., Martins-Silva, J., Saldanha, C. Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and molecular aspects. Biochemical Pharmacology. 65 (7), 1035-1041 (2003).
- Kolb, K. H., Jaenicke, G., Kramer, M., Schulze, P. E. Absorption, distribution and elimination of labeled dimethyl sulfoxide in man and animals. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 85-95 (1967).
- Yellowlees, P., Greenfield, C., McIntyre, N. Dimethylsulphoxide-incuded toxicity. Lancet. 2 (8202), 1004-1006 (1980).
- Swanson, B. N. Medical use of dimethyl sulfoxide (DMSO). Reviews in Clinical & Basic Pharmacology. 5 (1-2), 1-33 (1985).
