JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Imunologia e Infecção

Oral kombinationsmæssig antiretroviral behandling i HIV-1-inficerede humaniserede mus

Published: October 06, 2022
doi:
10.3791/63696
, , , , , ,
1Division of Hematology and Oncology, David Geffen School of Medicine,University of California, Los Angeles

Summary

Denne protokol beskriver en ny metode til at levere orale kombinationsmæssige antiretrovirale lægemidler, der med succes undertrykker HIV-1 RNA-replikation i humaniserede mus.

Abstract

Pandemien med human immundefektvirus (HIV-1) fortsætter med at sprede sig med uformindsket styrke over hele verden, og i øjeblikket er der ingen vaccine tilgængelig mod hiv. Selvom kombinationsmæssig antiretroviral terapi (cART) har haft succes med at undertrykke viral replikation, kan den ikke fuldstændigt udrydde reservoiret fra HIV-inficerede individer. En sikker og effektiv kurstrategi mod hiv-infektion vil kræve flerstrengede metoder, og derfor er udviklingen af dyremodeller for HIV-1-infektion afgørende for udviklingen af hiv-kurforskning. Humaniserede mus rekapitulerer nøglefunktioner ved HIV-1-infektion. Den humaniserede musemodel kan inficeres af HIV-1, og viral replikation kan kontrolleres med cART-regimer. Desuden resulterer cART-afbrydelse i en hurtig viral rebound i humaniserede mus. Administration af cART til dyret kan imidlertid være ineffektiv, vanskelig eller giftig, og mange klinisk relevante cART-regimer kan ikke udnyttes optimalt. Sammen med at være potentielt usikker for forskere, indgiver administration af cART ved en almindeligt anvendt intensiv daglig injektionsprocedure stress ved fysisk fastholdelse af dyret. Den nye orale cART-metode til behandling af HIV-1-inficerede humaniserede mus beskrevet i denne artikel resulterede i undertrykkelse af viræmi under detektionsniveauet, øget hastighed af CD4 + restaurering og forbedret generel sundhed hos HIV-1-inficerede humaniserede mus.

Introduction

Den forventede levetid for kronisk human immundefektvirus (HIV)-inficerede personer er signifikant forbedret med kombinationsbaseret antiretroviral behandling (cART)1,2. cART reducerer med succes HIV-1-replikationen og øger CD4 + T-celletal til normalitet hos størstedelen af HIV-1 kronisk inficerede deltagere3, hvilket resulterer i forbedret generel sundhed og dramatisk reduceret sygdomsprogression4. Imidlertid etableres det latente HIV-1-reservoir, selv når ART initieres under akut infektion 5,6,7. Reservoirer fortsætter over år under ART, og hurtig viral rebound efter ART-afbrydelse er veldokumenteret 8,9. Mennesker, der lever med hiv på ART, er også udsat for en højere risiko for comorbiditeter som hjerte-kar-sygdomme, kræft og neuroforstyrrelser10,11,12. Derfor er der brug for en funktionel kur mod hiv. Dyremodeller for HIV-1-infektion giver åbenlyse fordele ved at udvikle og validere nye HIV-kurstrategier13,14,15. Humaniserede mus, som en lille dyremodel, kan give multilineage human immuncellerekonstitution i forskellige væv, hvilket giver mulighed for tæt undersøgelse af HIV-infektion16,17,18,19. Blandt humaniserede modeller rekapitulerer den humaniserede knoglemarv-lever-thymus (BLT) -model med succes kronisk HIV-1-infektion samt funktionelle humane immunresponser på HIV-1-infektion 20,21,22,23,24. Derfor er den humaniserede BLT-musemodel blevet brugt i vid udstrækning til at undersøge forskellige aspekter inden for HIV-forskningsområdet. Humaniserede BLT-mus er ikke kun veletablerede modeller til rekapitulering af vedvarende HIV-1-infektion og patogenese, men også følgeværktøjer til evaluering af celleterapibaserede interventionsstrategier. De nuværende forfattere og andre har vist, at den humaniserede BLT-musemodel rekapitulerer vedvarende HIV-1-infektion og patogenese 25,26,27 og giver værktøjer til at evaluere celleterapibaserede interventionsstrategier 28,29,30,31,32,33.

cART-regimer bestående af kombinationer af antiretrovirale lægemidler, der tages dagligt, undertrykker HIV-1-replikation til det punkt, at den virale belastning hos succesfuldt behandlede individer forbliver uopdagelig på lang sigt34. Resultaterne af behandling af HIV-inficerede humaniserede mus med klinisk relevante cART-regimer ligner dem, der observeres hos HIV-1-inficerede ART-behandlede individer22: HIV-1-niveauer undertrykkes under grænserne for påvisning og afbrydelse af cART resulterer i en rebound af HIV-replikation fra det latente reservoir35. Subkutan (SC)27,36,37 eller intraperitoneal (IP)37,38,39 injektion er den vej, der almindeligvis anvendes til cART-behandling hos humaniserede mus. Imidlertid fremkalder intensiv daglig injektion stress på dyr ved fysisk fastholdelse40. Det er også arbejdskrævende og potentielt usikkert for forskere på grund af øget eksponering for hiv, mens de bruger skarpe. Oral administration er ideel til at efterligne absorption, distribution og udskillelse af cART-lægemidler, der tages af HIV-1-inficerede individer. Oral administration involverer typisk tilpassede og ofte besværlige procedurer for at sætte de antiretrovirale lægemidler i steriliseret (nødvendigt på grund af musenes immundefekt) mad 24,37,41 eller vand 42,43,44,45,46 , som måske eller måske ikke er kemisk kompatibel med mange antiretrovirale lægemidler eller resulterer i noget, musene ikke let ville spise eller drikke (hvilket ville påvirke dosis- og lægemiddelniveauer i kroppen). Den nye peroral cART-administrationsmetode, der foreslås her, overgår tidligere leveringsforsøg på grund af dens kompatibilitet med forskellige typer antiretrovirale lægemidler, sikkerhed og nem forberedelse og administration og reduktion af dyrestress og angst som følge af den daglige injektion.

Tenofovirdisoproxilfumarat (TDF), Elvitegravir (ELV) og Raltegravir (RAL) er dårligt vandopløselige lægemidler. Interessant nok observeres øget biotilgængelighed af TDF med fedtholdige fødevarer, hvilket tyder på, at konkurrencedygtig hæmning af lipaser af fed mad kan give en vis beskyttelse for TDF47. Derfor blev DietGel Boost-kopper valgt til at erstatte almindelig gnaverchow som leveringsmetode baseret på deres beskedne fedtindhold (20,3 g pr. 100 g) sammenlignet med almindelig gnaverchow (10 g pr. 100 g) og en typisk fedtholdig musediæt (40-60 g pr. 100 g)48. Den samlede vægt af en kop er 75 g; Således vil hver kop indeholde mængden af mad og derfor lægemiddel, der er tilstrækkelig til fem mus over 3 dage.

Protocol

Anonymiseret humant føtalvæv blev erhvervet kommercielt. Dyreforsøg blev udført i henhold til protokoller godkendt af University of California, Los Angeles og (UCLA) Animal Research Committee (ARC) i overensstemmelse med alle føderale, statslige og lokale retningslinjer. Specifikt blev alle forsøgene udført i overensstemmelse med anbefalinger og retningslinjer for opstaldning og pleje af forsøgsdyr fra National Institutes of Health (NIH) og Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Car…

Representative Results

Hvis man antager, at en gennemsnitlig mus, der vejer 25 g, indtager 4 g mad om dagen, svarer den daglige lægemiddeldosis gennem oral indtagelse til 2,88 mg/kg TFV, 83 mg/kg FTC og 768 mg/kg RAL. For at teste, om det optimerede fødevareregime er giftigt og påvirker det generelle helbred sammenlignet med daglig injektion af cART, blev musenes vægt overvåget ugentligt før og under cART gennem oral eller subkutan injektion. Der var ingen signifikante vægtforskelle før cART-administration i hver gruppe (<strong class=…

Discussion

En oral cART-administrationsmetode er udviklet her til HIV-1-inficerede humaniserede mus ved at kombinere tre antiretrovirale lægemidler inden for mad med højt næringsindhold. Sammenlignet med administration ved daglige injektioner er oral levering lettere at bruge, begrænser administrationsfrekvensen, reducerer dyrehåndtering, minimerer stress og forbedrer sikkerheden55. Indtil dette tidspunkt har kun få undersøgelser i humaniserede mus 24,37,41 brugt madpiller indeholdende knuste ART-læg…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi vil gerne takke Dr. Romas Geleziunas og Jeff Murry og folkene hos Gilead for at levere de antiretrovirale lægemidler, der anvendes i denne undersøgelse. Dette arbejde blev finansieret af NCI 1R01CA239261-01 (til køkken), NIH Grants P30AI28697 (UCLA CFAR Virology Core, Gene and Cell Therapy Core og Humanized Mouse Core), U19AI149504 (: Kitchen & Chen), CIRM DISC2-10748, NIDA R01DA-52841 (til Zhen), NIAID R2120200174 (: Xie & Zhen), IRACDA K12 GM106996 (Carrillo). Dette arbejde blev også støttet af UCLA AIDS Institute, James B. Pendleton Charitable Trust og McCarthy Family Foundation.

Materials

60 mm petri dish Thermo Scientific Nunc 150288 For aliquoting ART food
APC anti-human CD8 Antibody Biolegend 344722 For flow cytometry
BD LSRFortessa BD biosciences For flow data collection
CD34 microbeads Miltenyi Biotec 130-046-702 For NSG-BLT mice generation
Centrifuge tubes Falcon 14-432-22 For dissolving ART
DietGel Boost ClearH2O 72-04-5022 For making ART food
Elvitegravir Gilead Gifted from Gilead
Emtricitabine Gilead Gifted from Gilead
FITC anti-human CD3 Antibody Biolegend 317306 For flow cytometry
Flowjo software FlowJo For flow cytometry data analysis
HIV-1 forward primer: 5′-CAATGGCAGCAATTTCACCA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 probe: 5′-[6-FAM]CCCACCAACAGGCGGCCT
TAACTG [Tamra-Q]-3′;		 IDT Customized For viral load RT-PCR
HIV-1 reverse primer: 5′-GAATGCCAAATTCCTGCTTGA-3′; IDT Customized For viral load RT-PCR
Human fetal tissue Advanced Bioscience Resources, Inc
Mice, strain NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ The Jackson Laboratory 5557 For constructing the humanized mice
Pacific Blue anti-human CD45 Biolegend 304022 For flow cytometry
PerCP anti-human CD4 Antibody Biolegend 300528 For flow cytometry
QIAamp Viral RNA Kits Qiagen  52904 For measuring viral load
Raltegravir Merck Gifted from Merck
Sterile cell scrapers Thermo Scientific 179693 For aliquoting ART food
TaqMan RNA-To-Ct 1-Step Kit Applied Biosystems 4392653 For plasma viral load detection
Tenofovir disoproxil fumarate Gilead Gifted from Gilead
Trimethoprim-Sulfamethoxazole Pharmaceutical Associates NDC 0121-0854-16 For keeping ART food sterile. Each 5mL teaspoon contains
200 mg Sulfamethoxazole, USP
40 mg Trimethoprim, USP
NMT 0.5% Alcohol
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Antiretroviral Therapy Cohort Collaboration. Life expectancy of individuals on combination antiretroviral therapy in high-income countries: a collaborative analysis of 14 cohort studies. Lancet. 372 (9635), 293-299 (2008).
  2. May, M. T., et al. Impact on life expectancy of HIV-1 positive individuals of CD4+ cell count and viral load response to antiretroviral therapy. AIDS. 28 (8), 1193-1202 (2014).
  3. Autran, B., et al. Positive effects of combined antiretroviral therapy on CD4+ T cell homeostasis and function in advanced HIV disease. Science. 277 (5322), 112-116 (1997).
  4. Palella, F. J., et al. Declining morbidity and mortality among patients with advanced human immunodeficiency virus infection. HIV outpatient study investigators. The New England Journal of Medicine. 338 (13), 853-860 (1998).
  5. Finzi, D., et al. Identification of a reservoir for HIV-1 in patients on highly active antiretroviral therapy. Science. 278 (5341), 1295-1300 (1997).
  6. Ananworanich, J., Dube, K., Chomont, N. How does the timing of antiretroviral therapy initiation in acute infection affect HIV reservoirs. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (1), 18-28 (2015).
  7. Whitney, J. B., et al. Rapid seeding of the viral reservoir prior to SIV viraemia in rhesus monkeys. Nature. 512 (7512), 74-77 (2014).
  8. Siliciano, J. D., et al. Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4 T cells. Nature Medicine. 9 (6), 727-728 (2003).
  9. Chun, T. W., Moir, S., Fauci, A. S. HIV reservoirs as obstacles and opportunities for an HIV cure. Nature Immunology. 16 (6), 584-589 (2015).
  10. Brothers, T. D., et al. Frailty in people aging with human immunodeficiency virus (HIV) infection. Journal of Infectious Disease. 210 (8), 1170-1179 (2014).
  11. D. A. D. Study Group. Use of nucleoside reverse transcriptase inhibitors and risk of myocardial infarction in HIV-infected patients enrolled in the D:A:D study: a multi-cohort collaboration. Lancet. 371 (9622), 1417-1426 (2008).
  12. Schouten, J., et al. Cross-sectional comparison of the prevalence of age-associated comorbidities and their risk factors between HIV-infected and uninfected individuals: the AGEhIV cohort study. Clinical Infectious Diseases. 59 (12), 1787-1797 (2014).
  13. Policicchio, B. B., Pandrea, I., Apetrei, C. Animal models for HIV cure research. Frontiers in Immunology. 7, 12 (2016).
  14. Hessell, A. J., Haigwood, N. L. Animal models in HIV-1 protection and therapy. Current Opinion in HIV and AIDS. 10 (3), 170-176 (2015).
  15. Ambrose, Z., KewalRamani, V. N., Bieniasz, P. D., Hatziioannou, T. HIV/AIDS: in search of an animal model. Trends in Biotechnology. 25 (8), 333-337 (2007).
  16. Melkus, M. W., et al. Humanized mice mount specific adaptive and innate immune responses to EBV and TSST-1. Nature Medicine. 12 (11), 1316 (2006).
  17. Lan, P., Tonomura, N., Shimizu, A., Wang, S., Yang, Y. G. Reconstitution of a functional human immune system in immunodeficient mice through combined human fetal thymus/liver and CD34+ cell transplantation. Blood. 108 (2), 487-492 (2006).
  18. Wege, A. K., Melkus, M. W., Denton, P. W., Estes, J. D., Garcia, J. V. Functional and phenotypic characterization of the humanized BLT mouse model. Current Topics in Microbiology and Immunology. 324, 149-165 (2008).
  19. Garcia, J. V. In vivo platforms for analysis of HIV persistence and eradication. The Journal of Clinical Investigation. 126 (2), 424-431 (2016).
  20. Carrillo, M. A., Zhen, A., Kitchen, S. G. The use of the humanized mouse model in gene therapy and immunotherapy for HIV and cancer. Frontiers in Immunology. 9, 746 (2018).
  21. Abeynaike, S., Paust, S. Humanized mice for the evaluation of novel HIV-1 therapies. Frontiers in Immunology. 12, 636775 (2021).
  22. Marsden, M. D., Zack, J. A. Humanized mouse models for human immunodeficiency virus infection. Annual Review of Virology. 4 (1), 393-412 (2017).
  23. Brainard, D. M., et al. Induction of robust cellular and humoral virus-specific adaptive immune responses in human immunodeficiency virus-infected humanized BLT mice. Journal of Virology. 83 (14), 7305-7321 (2009).
  24. Nischang, M., et al. Humanized mice recapitulate key features of HIV-1 infection: a novel concept using long-acting anti-retroviral drugs for treating HIV-1. PLoS One. 7 (6), 38853 (2012).
  25. Garcia-Beltran, W. F., et al. Innate immune reconstitution in humanized bone marrow-liver-thymus (HuBLT) mice governs adaptive cellular immune function and responses to HIV-1 infection. Frontiers in Immunology. 12, 667393 (2021).
  26. Cheng, L., et al. Blocking type I interferon signaling enhances T cell recovery and reduces HIV-1 reservoirs. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 269-279 (2017).
  27. Zhen, A., et al. Targeting type I interferon-mediated activation restores immune function in chronic HIV infection. The Journal of Clinical Investigation. 127 (1), 260-268 (2017).
  28. Khamaikawin, W., et al. Modeling anti-HIV-1 HSPC-based gene therapy in humanized mice previously infected with HIV-1. Molecular Therapy Methods & Clinical Development. 9, 23-32 (2018).
  29. Kitchen, S. G., et al. Engineering antigen-specific T cells from genetically modified human hematopoietic stem cells in immunodeficient mice. PLoS One. 4 (12), 8208 (2009).
  30. Zhen, A., et al. Robust CAR-T memory formation and function via hematopoietic stem cell delivery. PLoS Pathogens. 17 (4), 1009404 (2021).
  31. Zhen, A., et al. HIV-specific immunity derived from chimeric antigen receptor-engineered stem cells. Molecular Therapy. 23 (8), 1358-1367 (2015).
  32. Zhen, A., Kitchen, S. Stem-cell-based gene therapy for HIV infection. Viruses. 6 (1), 1-12 (2013).
  33. Mu, W., Carrillo, M. A., Kitchen, S. G. Engineering CAR T cells to target the hiv reservoir. Frontiers in Celluar and Infection Microbiology. 10, 410 (2020).
  34. Arts, E. J., Hazuda, D. J. HIV-1 antiretroviral drug therapy. Cold Spring Harbour Perspectives in Medicine. 2 (4), 007161 (2012).
  35. Denton, P. W., et al. Generation of HIV latency in humanized BLT mice. Journal of Virology. 86 (1), 630-634 (2012).
  36. Kovarova, M., et al. A long-acting formulation of the integrase inhibitor raltegravir protects humanized BLT mice from repeated high-dose vaginal HIV challenges. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 71 (6), 1586-1596 (2016).
  37. Lavender, K. J., et al. An advanced BLT-humanized mouse model for extended HIV-1 cure studies. AIDS. 32 (1), 1-10 (2018).
  38. Denton, P. W., et al. Targeted cytotoxic therapy kills persisting HIV infected cells during ART. PLoS Pathogens. 10 (1), 1003872 (2014).
  39. Marsden, M. D., et al. In vivo activation of latent HIV with a synthetic bryostatin analog effects both latent cell "kick" and "kill" in strategy for virus eradication. PLoS Pathogens. 13 (9), 1006575 (2017).
  40. Stuart, S. A., Robinson, E. S. Reducing the stress of drug administration: implications for the 3Rs. Science Report. 5, 14288 (2015).
  41. Halper-Stromberg, A., et al. Broadly neutralizing antibodies and viral inducers decrease rebound from HIV-1 latent reservoirs in humanized mice. Cell. 158 (5), 989-999 (2014).
  42. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics reduce systemic and gut inflammation in chronic treated HIV. PLoS Pathogens. 18 (1), 1010160 (2022).
  43. Mu, W., et al. Apolipoprotein A-I mimetics attenuate macrophage activation in chronic treated HIV. AIDS. 35 (4), 543-553 (2021).
  44. Daskou, M., et al. ApoA-I mimetics favorably impact cyclooxygenase 2 and bioactive lipids that may contribute to cardiometabolic syndrome in chronic treated HIV. Metabolism. 124, 154888 (2021).
  45. Satheesan, S., et al. HIV replication and latency in a humanized NSG mouse model during suppressive oral combinational antiretroviral therapy. Journal of Virology. 92 (7), 02118 (2018).
  46. Llewellyn, G. N., et al. Humanized mouse model of HIV-1 latency with enrichment of latent virus in PD-1(+) and TIGIT(+) CD4 T cells. Journal of Virology. 93 (10), 02086 (2019).
  47. Kearney, B. P., Flaherty, J. F., Shah, J. Tenofovir disoproxil fumarate: clinical pharmacology and pharmacokinetics. Clinical Pharmacokinetics. 43 (9), 595-612 (2004).
  48. Speakman, J. R. Use of high-fat diets to study rodent obesity as a model of human obesity. International Journal of Obesity (Lond). 43 (8), 1491-1492 (2019).
  49. Zhen, A., et al. Stem-cell based engineered immunity against HIV infection in the humanized mouse model. Journal of Visualized Experiments. (113), e54048 (2016).
  50. Mopin, A., Driss, V., Brinster, C. A detailed protocol for characterizing the murine C1498 cell line and its associated leukemia mouse model. Journal of Visualized Experiments. (116), e54270 (2016).
  51. Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model. Lab Animal (NY). 37 (1), 26-32 (2008).
  52. Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal (NY). 40 (5), 155-160 (2011).
  53. Shimizu, S., et al. A highly efficient short hairpin RNA potently down-regulates CCR5 expression in systemic lymphoid organs in the hu-BLT mouse model. Blood. 115 (8), 1534-1544 (2010).
  54. Ladinsky, M. S., et al. Mechanisms of virus dissemination in bone marrow of HIV-1-infected humanized BLT mice. Elife. 8, 46916 (2019).
  55. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 50 (5), 600-613 (2011).
  56. Lamorde, M., et al. Effect of food on the steady-state pharmacokinetics of tenofovir and emtricitabine plus efavirenz in Ugandan adults. AIDS Research and Treatment. 2012, 105980 (2012).
  57. Watkins, M. E., et al. Development of a novel formulation that improves preclinical bioavailability of tenofovir disoproxil fumarate. Journal of Pharmaceutical Sciences. 106 (3), 906-919 (2017).
  58. Moccia, K. D., Olsen, C. H., Mitchell, J. M., Landauer, M. R. Evaluation of hydration and nutritional gels as supportive care after total-body irradiation in mice (Mus musculus). Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (3), 323-328 (2010).
  59. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).
  60. Santos, N. C., Figueira-Coelho, J., Martins-Silva, J., Saldanha, C. Multidisciplinary utilization of dimethyl sulfoxide: pharmacological, cellular, and molecular aspects. Biochemical Pharmacology. 65 (7), 1035-1041 (2003).
  61. Kolb, K. H., Jaenicke, G., Kramer, M., Schulze, P. E. Absorption, distribution and elimination of labeled dimethyl sulfoxide in man and animals. Annals of the New York Academy of Sciences. 141 (1), 85-95 (1967).
  62. Yellowlees, P., Greenfield, C., McIntyre, N. Dimethylsulphoxide-incuded toxicity. Lancet. 2 (8202), 1004-1006 (1980).
  63. Swanson, B. N. Medical use of dimethyl sulfoxide (DMSO). Reviews in Clinical & Basic Pharmacology. 5 (1-2), 1-33 (1985).

Tags

Keywords: Oral Antiretroviral TreatmentHIV-1Humanized MiceCARTFTCTDFRALELVDMSOTrimethoprim SulfamethoxazoleDrug DeliveryPreclinical StudiesHIV Cure
check_url/pt/63696?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Mu, W., Zhen, A., Carrillo, M. A., Rezek, V., Martin, H., Lizarraga, M., Kitchen, S. Oral Combinational Antiretroviral Treatment in HIV-1 Infected Humanized Mice. J. Vis. Exp. (188), e63696, doi:10.3791/63696 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image