Karakterisering van Salmonella Typhimurium-geïnduceerde septische peritonitis bij muizen
Summary
Dit protocol beschrijft de inductie van Gram-negatieve monobacteriële sepsis in een muismodelsysteem. Het model is nuttig bij het onderzoeken van de inflammatoire en dodelijke gastheerreacties tijdens sepsis.
Abstract
Sepsis is een ontregelde immuunrespons van de gastheer op microbiële invasie of weefselbeschadiging, wat leidt tot orgaanbeschadiging op een plaats die ver verwijderd is van die van de infectie of schade. Momenteel omvatten de veelgebruikte muizenmodellen van sepsis lipopolysaccharide (LPS) -geïnduceerde endotoxemie, cecale ligatie en punctie (CLP) en monobacteriële infectiemodelsystemen. Dit protocol beschrijft een methode om de gastheerresponsen te bestuderen tijdens Salmonella Typhimurium-infectie-geïnduceerde septische peritonitis bij muizen. S. Typhimurium, een Gram-negatieve intracellulaire ziekteverwekker, veroorzaakt tyfusachtige ziekte bij muizen.
Dit protocol werkt de kweekvoorbereiding, inductie van septische peritonitis bij muizen door intraperitoneale injectie en methoden om systemische gastheerresponsen te bestuderen uit. Verder wordt de beoordeling van bacteriële belasting in verschillende organen en de flowcytometrische analyse van verhoogde neutrofielenaantallen in de peritoneale lavage gepresenteerd. Salmonella Typhimurium-geïnduceerde sepsis bij muizen leidt tot een toename van pro-inflammatoire cytokines en snelle infiltratie van neutrofielen in de peritoneale holte, wat leidt tot een lagere overleving.
Elke stap in dit protocol is geoptimaliseerd, wat resulteert in een hoge reproduceerbaarheid van de pathogenese van septische peritonitis. Dit model is nuttig voor het bestuderen van immunologische reacties tijdens bacteriële sepsis, de rol van verschillende genen in ziekteprogressie en de effecten van geneesmiddelen om sepsis te dempen.
Introduction
Sepsis wordt gedefinieerd als een ontregelde systemische ontstekings- en immuunrespons op microbiële invasie of weefselbeschadiging, wat leidt tot orgaanbeschadiging ver weg van de plaats van infectie of schade. Septische shock is een subgroep van sepsis die wordt gekenmerkt door hypotensie die aanhoudt tijdens volumereanimatie, met een aanzienlijk verhoogd risico op mortaliteit1. Het grote publiek is zich meer bewust geworden van deze aandoening tijdens de COVID-19-pandemie. Ondanks de hoge geassocieerde mortaliteit ontbreken uitgebreide epidemiologische gegevens over de wereldwijde last van sepsis vanwege de complexiteit van de diagnose. In 2017 waren er wereldwijd 48,9 miljoen sepsis-incidenties en 11 miljoen sterfgevallen, goed voor 19,7% van alle wereldwijde sterfgevallen2. Verder bleek uit een onderzoek naar de uitgebreide prevalentie van infectie en gerelateerde sepsis bij patiënten op de intensive care dat 62% van de positieve isolaten van patiënten Gram-negatieve organismen waren3.
Aanvankelijk richtten de onderzoeken naar sepsis zich op het afbakenen van microbiële pathogenese. Het begrijpen van de “gevaarhypothese”, die dicteert hoe de gastheer zichzelf en niet-zelf onderscheidt, leidde echter tot het kantelen van de balans van sepsisonderzoek naar het begrijpen van de gastheerrespons op een binnendringende ziekteverwekker. De meest gebruikte muizenmodellen van sepsis omvatten het lipopolysaccharide (LPS)-geïnduceerde endotoxemiemodel, polymicrobiale sepsismodellen, cecale ligatie en punctie (CLP) en colon ascendens stent peritonitis (CASP) en monobacteriële infectiemodellen4.
We hebben een muismodelsysteem gestandaardiseerd door peritoneale sepsis te induceren met behulp van Salmonella Typhimurium. Dit model is voordelig ten opzichte van anderen omdat Salmonella Typhimurium een intracellulair pathogeen is dat de klinisch relevante toestand van Gram-negatieve sepsis nabootst. De uitkomst van peritonitis sepsis in dit model is systemisch, met 100% mortaliteit binnen 96 uur na infectie. Daarom is dit model instrumenteel bij het bestuderen van de inflammatoire en dodelijke gastheerreacties. In dit model wordt sepsis geïnduceerd door intraperitoneaal injecteren van 0,5 miljoen kolonievormende eenheden (CFU) van Salmonella Typhimurium in een 8-10 weken oude C57BL / 6-muis. Systemische infectie kan worden bevestigd door het beoordelen van orgaan bacteriële belasting ~ 16 uur na infectie. Dit artikel toont Salmonella Typhimurium-geïnduceerde peritonitis sepsis bij muizen, karakteriseert de resulterende veranderingen in peritoneale celsamenstelling en kwantificeert bacteriële belasting in verschillende organen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit artikel beschrijft een methode voor het induceren van een ernstige vorm van bacteriële sepsis door intraperitoneale injectie van Salmonella Typhimurium. Dit model is voordelig ten opzichte van anderen, omdat Salmonella Typhimurium een intracellulair pathogeen is en dus hoogpathogeen, dat de klinisch relevante toestand van Gram-negatieve sepsis nabootst. De uitkomst van peritonitis sepsis in dit model is systemisch, met 100% mortaliteit binnen 96 uur na infectie. Daarom is dit model instrumenteel in…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken de Central Animal Facility, IISc voor het leveren van muizen voor onderzoek. Deze studie werd gefinancierd door subsidies aan DpN van het Department of Biotechnology and Science and Engineering Research Board, Government of India. De infrastructurele ondersteuning van het DBT-IISc-programma en DST-FIST-subsidies worden zeer erkend. Wij danken alle eerdere en huidige leden van het DpN lab voor hun steun.
Materials
| Consumables | |||
| 1 mL Sterile Syringe with 26 G needle | Beckton Dickinson, Singapore | 303060 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tube | Tarsons, USA | 500010 | |
| 10 mL Sterile Syringe with 21 G needle | Beckton Dickinson, Spain | 307758 | |
| 50 mL Conical Flask | Tarsons, USA | 441150 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546041 | |
| 50 mL Graduated Centrifuge Tube | Tarsons, USA | 546021 | |
| Cell spreader | VWR, USA | VWRU60828-680 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | HiMedia, Mumbai, India | TS1006 | |
| Ethanol | Merck | 100983 | |
| FcR blocker | BD Biosciences | 553142 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| FITC Rat anti-mouse Ly6G (Clone 1A8) | BD Pharmingen | 551460 | |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | G9012 | |
| Hand based Homogenizer | – | – | |
| Hemocytometer (Neubauer counting chamber) | Rohem, India | I.S. 10269 | |
| Luria Bertani Broth | HiMedia, Mumbai, India | M1245 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 158127 | |
| Petriplates | Tarsons, USA | 460091 | |
| RPMI | Himedia, Mumbai, India | AT060-10X1L | |
| Salmonella-Shigella Agar | HiMedia, Mumbai, India | M108 | |
| Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | |
| Equipments | |||
| Centrifuge | Kubota | ||
| Flow cytometer | BD FACSverse | ||
| Incubator | N-biotek | ||
| Spectrophotometer | Shimadzu | ||
| Weighing machine | Sartorius |
Referências
- Hotchkiss, R. S., et al. Sepsis and septic shock. Nature Reviews Disease Primers. 2 (1), 1-21 (2016).
- Rudd, K. E., et al. regional, and national sepsis incidence and mortality, 1990-2017: Analysis for the Global Burden of Disease Study. The Lancet. 395 (10219), 200-211 (2020).
- Vincent, J. L., et al. International study of the prevalence and outcomes of infection in intensive care units. JAMA. 302 (21), 2323-2329 (2009).
- Lewis, A. J., Seymour, C. W., Rosengart, M. R. Current murine models of sepsis. Surgical Infections. 17 (4), 385-393 (2016).
- Ta, L., Gosa, L., Nathanson, D. A. Biosafety and biohazards: Understanding biosafety levels and meeting safety requirements of a biobank. Biobanking. 1897, 213-225 (2019).
- Ray, A., Dittel, D. N. Isolation of Mouse Peritoneal Cavity Cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (35), e1488 (2010).
- Liu, X., Quan, N. Immune cell isolation from mouse femur bone marrow. Bio-protocol. 5 (20), 1631 (2015).
- Yadav, S., et al. Nitric oxide synthase 2 enhances the survival of mice during Salmonella Typhimurium infection-induced sepsis by increasing reactive oxygen species, inflammatory cytokines and recruitment of neutrophils to the peritoneal cavity. Free Radical Biology & Medicine. 116, 73-87 (2018).
- Verma, T., et al. Cell-free hemoglobin is a marker of systemic inflammation in mouse models of sepsis: A Raman spectroscopic study. Analyst. 146 (12), 4022-4032 (2021).
- Cassado, A. D. A., Lima, M. R. D., Bortoluci, K. R. Revisiting mouse peritoneal macrophages: Heterogeneity, development, and function. Frontiers in Immunology. 6, 225 (2015).
- Yadav, S., Verma, T., Chattopadhyay, A., Nandi, D. Factors affecting the pathophysiology of sepsis, an inflammatory disorder: Key roles of oxidative and nitrosative stress. Indian Journal of Inflammation Research. 3 (1), 2 (2019).
