Temizlenmiş Beyinlerde Astrositler ve Nöronlar Arasındaki Mekansal Etkileşimin İncelenmesi
Summary
CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve beyin temizlemeyi birleştirmek, aynı anda çok sayıda nöron ve astrositin araştırılmasına izin verir.
Abstract
CLARITY yöntemini kullanarak viral vektör iletimini ve doku temizlemeyi birleştirmek, aynı anda birkaç beyin hücresi türünü ve etkileşimlerini araştırmayı mümkün kılar. Viral vektör iletimi, aynı doku içinde farklı floresan renklerinde farklı hücre tiplerinin işaretlenmesini sağlar. Hücreler genetik olarak aktivite veya projeksiyon ile tanımlanabilir. Modifiye edilmiş bir CLARITY protokolü kullanarak, astrositlerin ve nöronların potansiyel örneklem büyüklüğü 2-3 büyüklük sırasına göre büyümüştür. CLARITY kullanımı, dilimler halinde bütününe sığmayacak kadar büyük olan astrositlerin tamamının görüntülenmesini ve somatanın tüm işlemleriyle incelenmesini sağlar. Ek olarak, astrositler ve farklı nöronal hücre tipleri arasındaki mekansal etkileşimi, yani her astrositik alandaki piramidal nöronların sayısını veya astrositler ile spesifik inhibitör nöron popülasyonları arasındaki yakınlığı araştırma fırsatı sunar. Bu makale, bu yöntemlerin nasıl uygulanacağını ayrıntılı olarak açıklamaktadır.
Introduction
Son yıllarda, astrosit fonksiyonu ve nöronal devrelerle nasıl etkileşime girdikleri bilgisi çarpıcı bir şekilde artmıştır. Astrositler plastisiteyi etkileyebilir 1,2, nöronal yaralanma sonrası iyileşmeye yardımcı olabilir3,4 ve hatta astrositlerin hafıza edinimi ve ödülündeki önemini gösteren son çalışmalarla, daha önce tamamen nöronal fonksiyonlar olarak kabul edilen 5,6,7 . Astrosit araştırmalarında özellikle ilgi çekici bir özellik, hipokampus ve diğer beyin yapılarında benzersiz mekansal organizasyonları koruyan hücrelerin mekansal düzenlemesidir 8,9,10. Hücre somataları arasında iç içe geçen nöronal dendritlerin aksine, hipokampal astrositler, süreçleri arasında hafif örtüşme ile görsel olarak ayırt edilebilir bölgelerde yaşarlar ve farklı alanlar yaratırlar 8,11,12,13. Astrositlerin nöronal devrelere katılımını destekleyen kanıtlar, bu tür popülasyonların ve alanlarındaki nöronların ayrıntılı anatomik tanımının eksikliğini desteklememektedir14.
Viral vektör transdüksiyon prosedürleri, transgenik hayvanlarla (TG) birlikte, beyin yapılarını, fonksiyonlarını ve hücre etkileşimlerini araştırmak için bir araç seti olarak popülerleştirilmiştir15,16. Farklı promotörlerin kullanılması, spesifik hücrelerin genetik özelliklerine, aktivasyon seviyelerine17,18 veya projeksiyon hedeflerine göre hedeflenmesini sağlar. Farklı virüsler, farklı popülasyonlarda farklı renkli floroforları ifade edebilir. Bir virüs, TG’deki floroforların endojen ekspresyonu ile birleştirilebilir veya TG hayvanları virüslere ihtiyaç duymadan kullanılabilir. Bu teknikler nöronal işaretleme için yaygın olarak kullanılmaktadır ve bazı laboratuvarlar bunları astrositler 5,9,19 gibi diğer hücre tiplerini hedeflemek için uzmanlaşmış modifikasyonlarla kullanmaya başlamıştır.
İlk olarak 201320,21’de tanımlanan CLARITY tekniği, mikroskobik yapıları sağlam bırakırken tüm beyni şeffaf hale getirerek kalın beyin dilimlerinin incelenmesini sağlar. İki yöntemi birleştirerek – viral vektör transdüksiyonu ve doku temizliği – farklı hücre tipi popülasyonları arasındaki uzamsal etkileşimleri inceleme seçeneği artık mevcuttur. Çoğu astrosit-nöron etkileşimi çalışması ince beyin dilimleri üzerinde gerçekleştirildi, bu da büyük alanları nedeniyle tamamlanmamış astrositlerin görüntüleriyle sonuçlandı ve böylece analiz edilen hücrelerin sayısını radikal bir şekilde kısıtladı. CLARITY tekniğinin kullanılması, aynı anda büyük ölçekli hacimlerde hücre popülasyonlarının tek hücreli çözünürlük karakterizasyonuna izin verir. Berrak beyinlerde floresan olarak etiketlenmiş hücre popülasyonlarının görüntülenmesi sinaptik çözünürlük sağlamaz, ancak astrositler ve çeşitli nöronal hücre tipleri arasındaki uzamsal etkileşimlerin kapsamlı bir şekilde karakterize edilmesine izin verir.
Bu nedenle, astrositlerin dorsal CA1 boyunca özelliklerini araştırmak ve tüm laminaları (Stratum Radyatum, piramidal tabaka ve Stratum Oriens) görüntülemek için bu son teknoloji teknikleri kullandık. On binlerce astrositi ölçtük (viral penetransı >% 965 ile), böylece CA1 çevresindeki tüm astrositik popülasyonun bilgilerini analiz ettik. Nöronal belirteçlerin etkili penetransı ile, CA1 astrositlerinin tüm popülasyonu ile dört tip nöronal hücre-parvalbümin (PV), somatostatin (SST), VIP inhibitör nöronlar ve uyarıcı piramidal hücreler arasındaki etkileşimleri kaydedebiliriz9.
TG hayvanlarından floresan ve farklı renkli viral vektörlerin (tüm inhibitör hücreler) bir kombinasyonu kullanılarak çeşitli deneyler yapılırken, diğerleri (uyarıcı) farklı promotörler altında farklı floroforları ifade eden iki viral vektör kullandı9. Bu makale, beyinde istenen hücrelerin etiketlenmesi, değiştirilmiş bir CLARITY prosedürü kullanılarak beynin şeffaf hale getirilmesinin yanı sıra çeşitli prosedürler ve yazılımlar kullanarak tüm beyin yapılarının görüntülenmesi ve analiz edilmesi de dahil olmak üzere ayrıntılı bir protokol sunmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Doku temizleme yöntemleri, beyin araştırmalarında devrim niteliğinde bir araç sunarak, daha önce sorulamayan soruları davet ediyor. Küçük bir hücre grubunun, tek bir hücrenin veya hatta tek bir sinapsın özelliklerini hedeflemekten, CLARITY artık ilgili floroforları kullanarak toplam hücre popülasyonlarının veya uzun menzilli bağlantı özelliklerinin hedeflenmesini sağlar.
Florofor ekspresyonu ve CLARITY prosedür kombinasyonunun sonucu ikili değildir; birçok faktör p…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu proje, Avrupa Birliği’nin Horizon 2020 araştırma ve inovasyon programı (hibe anlaşması No 803589), İsrail Bilim Vakfı (ISF hibe No. 1815/18) ve Kanada-İsrail hibeleri (CIHR-ISF, hibe No. 2591/18) kapsamında Avrupa Araştırma Konseyi’nden (ERC) finansman almıştır. Nechama Novic’e tüm el yazması hakkında yorum yaptığı için teşekkür ederiz.
Materials
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight – 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight – 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
Referências
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease. Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).
- Sylvain, N. J., et al. The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).
- Kitchen, P., et al. Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema. Cell. 181 (4), 784-799 (2020).
- Adamsky, A., et al. Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement. Cell. 174 (1), 59-71 (2018).
- Adamsky, A., Goshen, I. Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions. Neurociência. 370, 14-26 (2018).
- Nagai, J., et al. Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits. Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Refaeli, R., et al. Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons. Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).
- Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human. eLife. 5, 15915 (2016).
- Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Chai, H., et al. Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- DeNardo, L. A., et al. Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval. Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
