Under de senaste åren har kunskapen om astrocytfunktion och hur de interagerar med neuronala kretsar ökat dramatiskt. Astrocyter kan påverka plasticitet ^1,2, hjälpa till med neuronal återhämtning efter skada ^3,4 och till och med inducera de novo neuronal potentiering, med nyligen genomförda studier som visar vikten av astrocyter vid minnesförvärv och belöning, som tidigare betraktades som rent neuronala funktioner ^5,6,7 . En egenskap av särskilt intresse för astrocytforskning är cellernas rumsliga arrangemang, som upprätthåller unika rumsliga organisationer i hippocampus och andra hjärnstrukturer ^8,9,10. Till skillnad från de neuronala dendriterna som sammanflätas mellan cellsomater, bor hippocampala astrocyter visuellt urskiljbara territorier med liten överlappning mellan deras processer, vilket skapar distinkta domäner 8,11,12,13. Bevisen som stöder astrocyternas deltagande i neuronala kretsar stöder inte bristen på detaljerad anatomisk beskrivning av sådana populationer och neuronerna i deras domäner¹⁴.

Virala vektortransduktionsförfaranden, tillsammans med transgena djur (TG), har populariserats som en verktygssats för att undersöka hjärnstrukturer, funktioner och cellinteraktioner^15,16. Användningen av olika promotorer möjliggör inriktning av specifika celler enligt deras genetiska egenskaper, aktiveringsnivåer^17,18 eller projektionsmål. Olika virus kan uttrycka olika färgade fluoroforer i olika populationer. Ett virus kan kombineras med det endogena uttrycket av fluoroforer i TG, eller TG-djur kan användas utan behov av virus. Dessa tekniker används ofta för neuronal märkning, och vissa laboratorier har börjat använda dem med modifieringar specialiserade för att rikta in sig på andra celltyper, såsom astrocyter ^5,9,19.

CLARITY-tekniken, som först beskrevs 2013 ^20,21, möjliggör studier av tjocka hjärnskivor genom att göra hela hjärnan transparent samtidigt som de mikroskopiska strukturerna lämnas intakta. Genom att kombinera de två metoderna – viral vektortransduktion och vävnadsrensning – är möjligheten att undersöka de rumsliga interaktionerna mellan olika celltyppopulationer nu tillgänglig. De flesta astrocyt-neuroninteraktionsstudier utfördes på tunna hjärnskivor, vilket resulterade i bilder av ofullständiga astrocyter på grund av deras stora domäner, vilket radikalt begränsade antalet analyserade celler. Användningen av CLARITY-tekniken möjliggör encellsupplösningskarakterisering av cellpopulationer i storskaliga volymer samtidigt. Avbildning av fluorescerande märkta cellpopulationer i klara hjärnor ger inte synaptisk upplösning men möjliggör grundlig karakterisering av de rumsliga interaktionerna mellan astrocyter och en mängd olika neuronala celltyper.

Av den anledningen utnyttjade vi dessa toppmoderna tekniker för att undersöka egenskaperna hos astrocyter i hela dorsal CA1, avbildning av all lamina (Stratum Radiatum, pyramidal layer och Stratum Oriens). Vi mätte tiotusentals astrocyter (med viral penetrans på >96%⁵) och analyserade därmed informationen från hela den astrocytiska befolkningen runt CA1. Med effektiv penetrans av neuronala markörer kunde vi registrera interaktionerna mellan hela populationen av CA1-astrocyter och de fyra typerna av neuronala celler-parvalbumin (PV), somatostatin (SST), VIP-hämmande neuroner och excitatoriska pyramidala celler⁹.

Flera experiment utfördes med användning av en kombination av fluorescens från TG-djur och olikfärgade virusvektorer (alla hämmande celler), medan andra (excitatoriska) använde två virala vektorer som uttryckte olika fluoroforer under olika promotorer⁹. Detta dokument presenterar ett detaljerat protokoll, inklusive märkning av önskade celler i hjärnan, vilket gör hjärnan transparent med hjälp av ett modifierat CLARITY-förfarande, samt avbildning och analys av kompletta hjärnstrukturer, med hjälp av olika procedurer och programvara.