В последние годы знания о функции астроцитов и о том, как они взаимодействуют с нейронными цепями, резко возросли. Астроциты могут влиять на пластичность ^1,2, помогать в восстановлении нейронов после травмы ^3,4 и даже индуцировать de novo нейрональное потенцирование, причем недавние исследования демонстрируют важность астроцитов в приобретении памяти и вознаграждении, ранее рассматриваемых как чисто нейронные функции ^5,6,7 . Особенностью, представляющей особый интерес в исследованиях астроцитов, является пространственное расположение клеток, которые поддерживают уникальные пространственные организации в гиппокампе и других структурах мозга ^8,9,10. В отличие от нейрональных дендритов, которые переплетаются между клеточными соматами, астроциты гиппокампа населяют визуально различимые территории с небольшим перекрытием между их процессами, создавая отчетливые домены 8,11,12,13. Доказательства, подтверждающие участие астроцитов в нейронных цепях, не подтверждают отсутствие подробного анатомического описания таких популяций и нейронов в их доменах¹⁴.

Процедуры трансдукции вирусных векторов, наряду с трансгенными животными (ТГ), были популяризированы в качестве набора инструментов для исследования структур, функций и клеточных взаимодействий мозга^15,16. Использование различных промоторов позволяет нацеливаться на конкретные клетки в соответствии с их генетическими свойствами, уровнями активации^17,18 или проекционными мишенями. Различные вирусы могут экспрессировать различные цветные флуорофоры в разных популяциях. Вирус может сочетаться с эндогенной экспрессией флуорофоров в ТГ, или ТГ животных можно использовать без необходимости в вирусах. Эти методы широко используются для маркировки нейронов, и некоторые лаборатории начали использовать их с модификациями, специализированными для нацеливания на другие типы клеток, такие как астроциты ^5,9,19.

Метод CLARITY, впервые описанный в 2013 году^20,21, позволяет изучать толстые срезы мозга, делая весь мозг прозрачным, оставляя микроскопические структуры нетронутыми. Объединив два метода — вирусную векторную трансдукцию и очистку тканей — теперь доступен вариант изучения пространственных взаимодействий между различными популяциями клеточных типов. Большинство исследований взаимодействия астроцитов и нейронов проводились на тонких срезах мозга, что приводило к изображениям неполных астроцитов из-за их больших доменов, тем самым радикально ограничивая количество анализируемых клеток. Использование метода CLARITY позволяет одновременно характеризовать одноклеточные популяции клеток в крупномасштабных объемах. Визуализация флуоресцентно помеченных клеточных популяций в чистом мозге не обеспечивает синаптического разрешения, но позволяет тщательно охарактеризовать пространственные взаимодействия между астроцитами и различными типами нейрональных клеток.

По этой причине мы использовали эти современные методы для исследования свойств астроцитов по всему дорсальному CA1, визуализируя всю пластинку (Stratum Radiatum, пирамидальный слой и Stratum Oriens). Мы измерили десятки тысяч астроцитов (с вирусной пенетрантностью >96%⁵), тем самым проанализировав информацию всей астроцитарной популяции вокруг CA1. При эффективном проникновении нейронных маркеров мы могли бы регистрировать взаимодействия между всей популяцией астроцитов CA1 и четырьмя типами нейронных клеток — парвальбумином (PV), соматостатином (SST), VIP-тормозными нейронами и возбуждающими пирамидальными клетками⁹.

Несколько экспериментов были проведены с использованием комбинации флуоресценции животных ТГ и разноцветных вирусных векторов (все ингибирующие клетки), в то время как другие (возбуждающие) использовали два вирусных вектора, экспрессирующих разные флуорофоры под разными промоторами⁹. В этой статье представлен подробный протокол, включая маркировку желаемых клеток в мозге, обеспечение прозрачности мозга с помощью модифицированной процедуры CLARITY, а также визуализацию и анализ полных структур мозга с использованием различных процедур и программного обеспечения.