De siste årene har kunnskapen om astrocyttfunksjon og hvordan de samhandler med nevronkretser økt dramatisk. Astrocytter kan påvirke plastisitet ^1,2, bistå i nevronal postinjury utvinning ^3,4, og til og med indusere de novo nevronal potensiering, med nyere studier som viser betydningen av astrocytter i minneoppkjøp og belønning, tidligere ansett som rent nevronale funksjoner ^5,6,7 . Et trekk ved spesiell interesse for astrocyttforskning er det romlige arrangementet av cellene, som opprettholder unike romlige organisasjoner i hippocampus og andre hjernestrukturer ^8,9,10. I motsetning til de nevronale dendrittene som blander seg mellom celle somata, beboer hippocampale astrocytter visuelt skille territorier med liten overlapping mellom prosessene sine, og skaper forskjellige domener 8,11,12,13. Bevisene som støtter deltakelse av astrocytter i nevronkretser støtter ikke mangelen på detaljert anatomisk beskrivelse av slike populasjoner og nevronene i deres domener¹⁴.

Virale vektortransduksjonsprosedyrer, sammen med transgene dyr (TG), har blitt popularisert som et verktøysett for å undersøke hjernestrukturer, funksjoner og celleinteraksjoner^15,16. Bruken av forskjellige promotorer tillater målretting av spesifikke celler i henhold til deres genetiske egenskaper, aktiveringsnivåer^17,18 eller projeksjonsmål. Ulike virus kan uttrykke forskjellige fargede fluoroforer i forskjellige populasjoner. Et virus kan kombineres med det endogene uttrykket av fluoroforer i TG, eller TG-dyr kan brukes uten behov for virus. Disse teknikkene er mye brukt til nevronmarkering, og noen laboratorier har begynt å bruke dem med modifikasjoner spesialisert for å målrette mot andre celletyper, for eksempel astrocytter ^5,9,19.

CLARITY-teknikken, først beskrevet i 2013^20,21, muliggjør studiet av tykke hjerneskiver ved å gjøre hele hjernen gjennomsiktig mens du lar de mikroskopiske strukturene være intakte. Ved å kombinere de to metodene-viral vektortransduksjon og vev clearing-muligheten til å undersøke romlige interaksjoner mellom ulike celle type populasjoner er nå tilgjengelig. De fleste astrocytt-neuron interaksjonsstudier ble utført på tynne hjerneskiver, noe som resulterte i bilder av ufullstendige astrocytter på grunn av deres store domener, og dermed radikalt begrense antall analyserte celler. Bruken av CLARITY-teknikken tillater encellet oppløsningskarakterisering av cellepopulasjoner i store volumer samtidig. Avbildning av fluorescerende merkede cellepopulasjoner i klare hjerner gir ikke synaptisk oppløsning, men tillater grundig karakterisering av de romlige interaksjonene mellom astrocytter og en rekke nevronale celletyper.

Av den grunn utnyttet vi disse toppmoderne teknikkene for å undersøke egenskapene til astrocytter i hele dorsal CA1, og identifiserte alle lamina (Stratum Radiatum, pyramidelag og Stratum Oriens). Vi målte titusenvis av astrocytter (med viral penetrans på >96%⁵), og analyserte dermed informasjonen til hele den astrocytiske befolkningen rundt CA1. Med effektiv penetrans av nevronmarkørene kunne vi registrere interaksjonene mellom hele befolkningen i CA1 astrocytter og de fire typer nevronale celler-parvalbumin (PV), somatostatin (SST), VIP-hemmende nevroner og eksitatoriske pyramidale celler⁹.

Flere eksperimenter ble utført ved hjelp av en kombinasjon av fluorescens fra TG-dyr og forskjellige fargede virale vektorer (alle hemmende celler), mens andre (eksitatoriske) brukte to virale vektorer som uttrykte forskjellige fluoroforer under forskjellige promotorer⁹. Dette dokumentet presenterer en detaljert protokoll, inkludert merking av de ønskede cellene i hjernen, noe som gjør hjernen gjennomsiktig ved hjelp av en modifisert CLARITY-prosedyre, samt avbildning og analyse av komplette hjernestrukturer, ved hjelp av ulike prosedyrer og programvare.