साफ दिमाग में एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स के बीच स्थानिक बातचीत की जांच
Summary
CLARITY विधि का उपयोग करके वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन और मस्तिष्क समाशोधन के संयोजन से बड़ी संख्या में न्यूरॉन्स और एस्ट्रोसाइट्स की जांच एक साथ हो सकती है।
Abstract
CLARITY विधि का उपयोग करके वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन और ऊतक समाशोधन के संयोजन से मस्तिष्क कोशिकाओं के कई प्रकार और उनकी बातचीत की एक साथ जांच करना संभव हो जाता है। वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन एक ही ऊतक के भीतर विभिन्न प्रतिदीप्ति रंगों में विभिन्न सेल प्रकारों के अंकन को सक्षम बनाता है। कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से गतिविधि या प्रक्षेपण द्वारा पहचाना जा सकता है। एक संशोधित स्पष्टता प्रोटोकॉल का उपयोग करते हुए, एस्ट्रोसाइट्स और न्यूरॉन्स का संभावित नमूना आकार परिमाण के 2-3 आदेशों से बढ़ गया है। स्पष्टता का उपयोग पूर्ण एस्ट्रोसाइट्स की इमेजिंग की अनुमति देता है, जो स्लाइस में अपनी संपूर्णता में फिट होने के लिए बहुत बड़े हैं, और उनकी सभी प्रक्रियाओं के साथ सोमाटा की परीक्षा। इसके अलावा, यह एस्ट्रोसाइट्स और विभिन्न न्यूरोनल सेल प्रकारों के बीच स्थानिक बातचीत की जांच करने का अवसर प्रदान करता है, अर्थात्, प्रत्येक एस्ट्रोसाइटिक डोमेन में पिरामिड न्यूरॉन्स की संख्या या एस्ट्रोसाइट्स और विशिष्ट निरोधात्मक न्यूरॉन आबादी के बीच निकटता। यह पेपर विस्तार से वर्णन करता है कि इन विधियों को कैसे लागू किया जाना है।
Introduction
हाल के वर्षों में, एस्ट्रोसाइट फ़ंक्शन का ज्ञान और वे न्यूरोनल सर्किट के साथ कैसे बातचीत करते हैं, नाटकीय रूप से बढ़ गया है। एस्ट्रोसाइट्स प्लास्टिसिटी 1,2 को प्रभावित कर सकते हैं, न्यूरोनल पोस्टइंजरी रिकवरी 3,4 में सहायता कर सकते हैं, और यहां तक कि डे नोवो न्यूरोनल potentiation को प्रेरित कर सकते हैं, हाल के अध्ययनों में स्मृति अधिग्रहण और इनाम में एस्ट्रोसाइट्स के महत्व को प्रदर्शित किया गया है, जिसे पहले विशुद्ध रूप से न्यूरोनल कार्यों के रूप में माना जाता है 5,6,7 . एस्ट्रोसाइट अनुसंधान में विशेष रुचि की एक विशेषता कोशिकाओं की स्थानिक व्यवस्था है, जो हिप्पोकैम्पस और अन्य मस्तिष्क संरचनाओं में अद्वितीय स्थानिक संगठनों को बनाए रखतीहै 8,9,10। न्यूरोनल डेंड्राइट्स के विपरीत जो सेल सोमाटा के बीच इंटरटॉइन करते हैं, हिप्पोकैम्पल एस्ट्रोसाइट्स अपनी प्रक्रियाओं के बीच मामूली ओवरलैप के साथ नेत्रहीन रूप से अलग-अलग क्षेत्रों में निवास करते हैं, जिससे अलग-अलग डोमेन 8,11,12,13 बनते हैं। न्यूरोनल सर्किट में एस्ट्रोसाइट्स की भागीदारी का समर्थन करने वाले सबूत इस तरह की आबादी और उनके डोमेन में न्यूरॉन्स के विस्तृत शारीरिक विवरण की कमी का समर्थन नहीं करतेहैं।
वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन प्रक्रियाओं, ट्रांसजेनिक जानवरों (टीजी) के साथ, मस्तिष्क संरचनाओं, कार्यों और सेल इंटरैक्शन15,16 की जांच करने के लिए एक टूलसेट के रूप में लोकप्रिय किया गया है। विभिन्न प्रवर्तकों का उपयोग उनके आनुवंशिक गुणों, सक्रियण स्तर17,18, या प्रक्षेपण लक्ष्यों के अनुसार विशिष्ट कोशिकाओं को लक्षित करने की अनुमति देता है। विभिन्न वायरस विभिन्न आबादी में अलग-अलग रंगीन फ्लोरोफोरस व्यक्त कर सकते हैं। एक वायरस को टीजी में फ्लोरोफोरस की अंतर्जात अभिव्यक्ति के साथ जोड़ा जा सकता है, या टीजी जानवरों का उपयोग वायरस की आवश्यकता के बिना किया जा सकता है। इन तकनीकों का व्यापक रूप से न्यूरोनल अंकन के लिए उपयोग किया जाता है, और कुछ प्रयोगशालाओं ने अन्य सेल प्रकारों को लक्षित करने के लिए विशेष संशोधनों के साथ उनका उपयोग करना शुरू कर दिया है, जैसे एस्ट्रोसाइट्स 5,9,19।
स्पष्टता तकनीक, पहली बार 201320,21 में वर्णित, माइक्रोस्कोपिक संरचनाओं को बरकरार रखते हुए पूरे मस्तिष्क को पारदर्शी बनाकर मोटे मस्तिष्क स्लाइस के अध्ययन को सक्षम बनाती है। दो तरीकों-वायरल वेक्टर ट्रांसडक्शन और ऊतक समाशोधन के संयोजन से- विभिन्न सेल प्रकार की आबादी के बीच स्थानिक बातचीत की जांच करने का विकल्प अब उपलब्ध है। अधिकांश एस्ट्रोसाइट-न्यूरॉन इंटरैक्शन अध्ययन पतले मस्तिष्क स्लाइस पर किए गए थे, जिसके परिणामस्वरूप उनके बड़े डोमेन के कारण अपूर्ण एस्ट्रोसाइट्स की छवियां होती हैं, इस प्रकार विश्लेषण की गई कोशिकाओं की संख्या को मौलिक रूप से प्रतिबंधित किया जाता है। CLARITY तकनीक का उपयोग एक साथ बड़े पैमाने पर वॉल्यूम में सेल आबादी के एकल-सेल रिज़ॉल्यूशन लक्षण वर्णन की अनुमति देता है। स्पष्ट दिमाग में इमेजिंग फ्लोरोसेंटली टैग की गई सेल आबादी सिनैप्टिक रिज़ॉल्यूशन प्रदान नहीं करती है, लेकिन एस्ट्रोसाइट्स और विभिन्न प्रकार के न्यूरोनल सेल प्रकारों के बीच स्थानिक इंटरैक्शन के पूरी तरह से लक्षण वर्णन की अनुमति देती है।
इस कारण से, हमने पृष्ठीय CA1 में एस्ट्रोसाइट्स के गुणों की जांच करने के लिए इन अत्याधुनिक तकनीकों का उपयोग किया, सभी लामिना (स्ट्रैटम रेडिएटम, पिरामिडल लेयर और स्ट्रैटम ओरियन्स) को इमेजिंग किया। हमने हजारों एस्ट्रोसाइट्स (>96%5 के वायरल पेनेट्रेंस के साथ) को मापा, जिससे सीए 1 के आसपास की पूरी एस्ट्रोसाइटिक आबादी की जानकारी का विश्लेषण किया जा सके। न्यूरोनल मार्करों के कुशल पेनेट्रेंस के साथ, हम सीए 1 एस्ट्रोसाइट्स की पूरी आबादी और चार प्रकार के न्यूरोनल कोशिकाओं-परवलब्यूमिन (पीवी), सोमाटोस्टेटिन (एसएसटी), वीआईपी निरोधात्मक न्यूरॉन्स और उत्तेजक पिरामिड कोशिकाओं के बीच बातचीत को रिकॉर्ड कर सकतेहैं।
टीजी जानवरों और अलग-अलग रंगीन वायरल वैक्टर (सभी निरोधात्मक कोशिकाओं) से प्रतिदीप्ति के संयोजन का उपयोग करके कई प्रयोग किए गए थे, जबकि अन्य (उत्तेजक) ने विभिन्न प्रमोटरों के तहत अलग-अलग फ्लोरोफोर को व्यक्त करने वाले दो वायरल वैक्टरका उपयोग किया था। यह पेपर एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है, जिसमें मस्तिष्क में वांछित कोशिकाओं की टैगिंग शामिल है, जो मस्तिष्क को एक संशोधित स्पष्टता प्रक्रिया का उपयोग करके पारदर्शी बनाती है, साथ ही साथ विभिन्न प्रक्रियाओं और सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके पूर्ण मस्तिष्क संरचनाओं की इमेजिंग और विश्लेषण करती है।
Protocol
Representative Results
Discussion
ऊतक समाशोधन विधियां मस्तिष्क अनुसंधान में एक क्रांतिकारी उपकरण प्रस्तुत करती हैं, जो उन प्रश्नों को आमंत्रित करती हैं जो पहले नहीं पूछे जा सकते थे। कोशिकाओं के एक छोटे समूह, एक एकल सेल, या यहां तक कि एक ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस परियोजना को यूरोपीय संघ के क्षितिज 2020 अनुसंधान और नवाचार कार्यक्रम (अनुदान समझौता नहीं 803589), इज़राइल साइंस फाउंडेशन (आईएसएफ अनुदान संख्या 1815/18), और कनाडा-इज़राइल अनुदान (CIHR-ISF, अनुदान संख्या 2591/18) के तहत यूरोपीय अनुसंधान परिषद (ERC) से धन प्राप्त हुआ है। हम पूरी पांडुलिपि पर टिप्पणी करने के लिए Nechama Novick धन्यवाद.
Materials
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight – 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight – 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
Referências
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