In de afgelopen jaren is de kennis van astrocytenfunctie en hoe ze interageren met neuronale circuits dramatisch toegenomen. Astrocyten kunnen de plasticiteit^{beïnvloeden 1,2}, helpen bij neuronaal postinjuryherstel ^3,4 en zelfs de novo neuronale potentiëring induceren, waarbij recente studies het belang van astrocyten in geheugenverwerving en beloning aantonen, voorheen beschouwd als puur neuronale functies ^5,6,7 . Een kenmerk van bijzonder belang in astrocytenonderzoek is de ruimtelijke ordening van de cellen, die unieke ruimtelijke organisaties in de hippocampus en andere hersenstructuren behouden ^8,9,10. In tegenstelling tot de neuronale dendrieten die zich verstrengelen tussen cel somata, bewonen hippocampale astrocyten visueel te onderscheiden gebieden met lichte overlap tussen hun processen, waardoor verschillende domeinen^ontstaan 8,11,12,13. Het bewijs dat de deelname van astrocyten aan neuronale circuits ondersteunt niet het gebrek aan gedetailleerde anatomische beschrijving van dergelijke populaties en de neuronen in hun domeinen¹⁴.

Virale vectortransductieprocedures, samen met transgene dieren (TG), zijn gepopulariseerd als een toolset om hersenstructuren, functies en celinteracties te onderzoeken^15,16. Het gebruik van verschillende promotors maakt het mogelijk om specifieke cellen te richten op basis van hun genetische eigenschappen, activeringsniveaus^17,18 of projectiedoelen. Verschillende virussen kunnen verschillende gekleurde fluoroforen uitdrukken in verschillende populaties. Een virus kan worden gecombineerd met de endogene expressie van fluoroforen in TG, of TG-dieren kunnen worden gebruikt zonder dat er virussen nodig zijn. Deze technieken worden veel gebruikt voor neuronale markering en sommige laboratoria zijn ze gaan gebruiken met modificaties die gespecialiseerd zijn voor het richten op andere celtypen, zoals astrocyten ^5,9,19.

De CLARITY-techniek, voor het eerst beschreven in 2013^20,21, maakt de studie van dikke hersenplakken mogelijk door de hele hersenen transparant te maken terwijl de microscopische structuren intact blijven. Door de combinatie van de twee methoden – virale vectortransductie en weefselverwijdering – is nu de mogelijkheid beschikbaar om de ruimtelijke interacties tussen verschillende celtypepopulaties te onderzoeken. De meeste astrocyten-neuron interactiestudies werden uitgevoerd op dunne hersenplakken, wat resulteerde in afbeeldingen van onvolledige astrocyten vanwege hun grote domeinen, waardoor het aantal geanalyseerde cellen radicaal werd beperkt. Het gebruik van de CLARITY-techniek maakt eencellige resolutiekarakterisering van celpopulaties in grootschalige volumes tegelijkertijd mogelijk. Het afbeelden van fluorescerend gelabelde celpopulaties in heldere hersenen levert geen synaptische resolutie op, maar maakt een grondige karakterisering van de ruimtelijke interacties tussen astrocyten en een verscheidenheid aan neuronale celtypen mogelijk.

Om die reden hebben we deze state-of-the-art technieken gebruikt om de eigenschappen van astrocyten in de dorsale CA1 te onderzoeken, waarbij we alle lamina (Stratum Radiatum, piramidale laag en Stratum Oriens) in beeld brengen. We hebben tienduizenden astrocyten gemeten (met virale penetrantie van >96%⁵), waarbij we de informatie van de hele astrocytische populatie rond CA1 hebben geanalyseerd. Met efficiënte penetrantie van de neuronale markers konden we de interacties registreren tussen de hele populatie van CA1-astrocyten en de vier soorten neuronale cellen- parvalbumine (PV), somatostatine (SST), VIP-remmende neuronen en exciterende piramidale cellen⁹.

Verschillende experimenten werden uitgevoerd met behulp van een combinatie van fluorescentie van TG-dieren en verschillend gekleurde virale vectoren (alle remmende cellen), terwijl anderen (exciterend) twee virale vectoren gebruikten die verschillende fluoroforen onder verschillende promotors tot expressie brachten⁹. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol, inclusief het taggen van de gewenste cellen in de hersenen, het transparant maken van de hersenen met behulp van een aangepaste CLARITY-procedure, evenals beeldvorming en analyse van volledige hersenstructuren, met behulp van verschillende procedures en software.