I de senere år er kendskabet til astrocytfunktion og hvordan de interagerer med neuronale kredsløb steget dramatisk. Astrocytter kan påvirke plasticitet ^1,2, hjælpe med neuronal genopretning efter mened ^3,4 og endda inducere de novo neuronal potensering, med nylige undersøgelser, der udviser astrocytternes betydning i hukommelseserhvervelse og belønning, tidligere betragtet som rent neuronale funktioner ^5,6,7 . Et træk af særlig interesse for astrocytforskning er cellernes rumlige arrangement, som opretholder unikke rumlige organisationer i hippocampus og andre hjernestrukturer ^8,9,10. I modsætning til de neuronale dendritter, der fletter sig ind mellem celle somata, beboer hippocampale astrocytter visuelt skelnelige territorier med let overlapning mellem deres processer, hvilket skaber forskellige domæner 8,11,12,13. Beviserne til støtte for astrocytters deltagelse i neuronale kredsløb understøtter ikke manglen på detaljeret anatomisk beskrivelse af sådanne populationer og neuronerne i deres domæner¹⁴.

Virale vektortransduktionsprocedurer sammen med transgene dyr (TG) er blevet populariseret som et værktøjssæt til at undersøge hjernestrukturer, funktioner og celleinteraktioner^15,16. Udnyttelsen af forskellige promotorer tillader målretning af specifikke celler i henhold til deres genetiske egenskaber, aktiveringsniveauer^17,18 eller projektionsmål. Forskellige vira kan udtrykke forskellige farvede fluoroforer i forskellige populationer. En virus kan kombineres med den endogene ekspression af fluoroforer i TG, eller TG-dyr kan anvendes uden behov for vira. Disse teknikker anvendes i vid udstrækning til neuronal mærkning, og nogle laboratorier er begyndt at bruge dem med modifikationer, der er specialiserede til at målrette mod andre celletyper, såsom astrocytter ^5,9,19.

CLARITY-teknikken, der først blev beskrevet i 2013^20,21, gør det muligt at studere tykke hjerneskiver ved at gøre hele hjernen gennemsigtig, samtidig med at de mikroskopiske strukturer forbliver intakte. Ved at kombinere de to metoder – viral vektortransduktion og vævsclearing – er muligheden for at undersøge de rumlige interaktioner mellem forskellige celletypepopulationer nu tilgængelig. De fleste astrocyt-neuron-interaktionsundersøgelser blev udført på tynde hjerneskiver, hvilket resulterede i billeder af ufuldstændige astrocytter på grund af deres store domæner, hvilket radikalt begrænsede antallet af analyserede celler. Anvendelsen af CLARITY-teknikken muliggør karakterisering af enkeltcelleopløsning af cellepopulationer i store mængder samtidigt. Billeddannelse fluorescerende mærkede cellepopulationer i klare hjerner leverer ikke synaptisk opløsning, men tillader grundig karakterisering af de rumlige interaktioner mellem astrocytter og en række neuronale celletyper.

Af den grund udnyttede vi disse state-of-the-art teknikker til at undersøge astrocytternes egenskaber i hele den dorsale CA1 og afbilde alle lamina (Stratum Radiatum, pyramidelag og Stratum Oriens). Vi målte titusinder af astrocytter (med viral penetrans på >96%⁵) og analyserede derved informationen om hele den astrocytiske befolkning omkring CA1. Med effektiv penetrans af neuronale markører kunne vi registrere interaktionerne mellem hele populationen af CA1-astrocytter og de fire typer neuronale celler-parvalbumin (PV), somatostatin (SST), VIP-hæmmende neuroner og excitatoriske pyramideceller⁹.

Flere eksperimenter blev udført ved anvendelse af en kombination af fluorescens fra TG-dyr og forskelligt farvede virale vektorer (alle hæmmende celler), mens andre (excitatoriske) anvendte to virale vektorer, der udtrykte forskellige fluoroforer under forskellige promotorer⁹. Dette papir præsenterer en detaljeret protokol, herunder mærkning af de ønskede celler i hjernen, hvilket gør hjernen gennemsigtig ved hjælp af en modificeret CLARITY-procedure samt billeddannelse og analyse af komplette hjernestrukturer ved hjælp af forskellige procedurer og software.