التحقيق في التفاعل المكاني بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية في الأدمغة الواضحة
Summary
يسمح الجمع بين نقل النواقل الفيروسية وتطهير الدماغ باستخدام طريقة CLARITY بالتحقيق في عدد كبير من الخلايا العصبية والخلايا النجمية في وقت واحد.
Abstract
إن الجمع بين نقل النواقل الفيروسية وإزالة الأنسجة باستخدام طريقة CLARITY يجعل من الممكن التحقيق في وقت واحد في عدة أنواع من خلايا الدماغ وتفاعلاتها. يتيح نقل النواقل الفيروسية وضع علامات على أنواع الخلايا المتنوعة بألوان فلورية مختلفة داخل نفس الأنسجة. يمكن تحديد الخلايا وراثيا عن طريق النشاط أو الإسقاط. باستخدام بروتوكول CLARITY المعدل ، نما حجم العينة المحتملة للخلايا النجمية والخلايا العصبية بمقدار 2-3 أوامر من الحجم. يسمح استخدام CLARITY بتصوير الخلايا النجمية الكاملة ، والتي هي أكبر من أن تتناسب بالكامل مع شرائح ، وفحص somata بجميع عملياتها. بالإضافة إلى ذلك ، فإنه يوفر الفرصة للتحقيق في التفاعل المكاني بين الخلايا النجمية وأنواع الخلايا العصبية المختلفة ، أي عدد الخلايا العصبية الهرمية في كل مجال من مجالات الخلايا النجمية أو القرب بين الخلايا النجمية ومجموعات الخلايا العصبية المثبطة المحددة. تصف هذه الورقة بالتفصيل كيفية تطبيق هذه الأساليب.
Introduction
في السنوات الأخيرة ، زادت معرفة وظيفة الخلايا النجمية وكيفية تفاعلها مع الدوائر العصبية بشكل كبير. يمكن للخلايا النجمية التأثير على اللدونة1,2 ، والمساعدة في استعادة الخلايا العصبية بعد الإصابة3,4 ، وحتى تحفيز التقوية العصبية الجديدة ، حيث أظهرت الدراسات الحديثة أهمية الخلايا النجمية في اكتساب الذاكرة ومكافأتها ، والتي كانت تعتبر سابقا وظائف عصبية بحتة 5,6,7 . ميزة ذات أهمية خاصة في أبحاث الخلايا النجمية هي الترتيب المكاني للخلايا ، والتي تحافظ على منظمات مكانية فريدة من نوعها في الحصين وهياكل الدماغ الأخرى8،9،10. على عكس التشعبات العصبية التي تتشابك بين سوماتا الخلية ، تعيش الخلايا النجمية الحصين في مناطق يمكن تمييزها بصريا مع تداخل طفيف بين عملياتها ، مما يخلق مجالات متميزة8،11،12،13. الأدلة التي تدعم مشاركة الخلايا النجمية في الدوائر العصبية لا تدعم عدم وجود وصف تشريحي مفصل لمثل هذه المجموعات والخلايا العصبية في مجالاتها14.
تم تعميم إجراءات نقل النواقل الفيروسية ، إلى جانب الحيوانات المعدلة وراثيا (TG) ، كمجموعة أدوات للتحقيق في هياكل الدماغ ووظائفه وتفاعلات الخلايا15,16. يسمح استخدام المروجين المختلفين باستهداف خلايا معينة وفقا لخصائصها الجينية أو مستويات التنشيط17,18 أو أهداف الإسقاط. يمكن للفيروسات المختلفة التعبير عن الفلوروفورات الملونة المختلفة في مجموعات سكانية مختلفة. يمكن الجمع بين الفيروس والتعبير الداخلي للفلوروفورات في TG ، أو يمكن استخدام TG دون الحاجة إلى الفيروسات. تستخدم هذه التقنيات على نطاق واسع لوضع العلامات العصبية ، وبدأت بعض المختبرات في استخدامها مع تعديلات متخصصة لاستهداف أنواع الخلايا الأخرى ، مثل الخلايا النجمية5،9،19.
تمكن تقنية CLARITY ، التي تم وصفها لأول مرة في عام2013 20,21 ، من دراسة شرائح الدماغ السميكة عن طريق جعل الدماغ بأكمله شفافا مع ترك الهياكل المجهرية سليمة. من خلال الجمع بين الطريقتين – نقل النواقل الفيروسية وتطهير الأنسجة – يتوفر الآن خيار فحص التفاعلات المكانية بين مجموعات مختلفة من أنواع الخلايا. تم إجراء معظم دراسات التفاعل بين الخلايا النجمية والخلايا العصبية على شرائح رقيقة من الدماغ ، مما أدى إلى صور للخلايا النجمية غير المكتملة بسبب مجالاتها الكبيرة ، مما أدى إلى تقييد عدد الخلايا التي تم تحليلها بشكل جذري. يسمح استخدام تقنية CLARITY بتوصيف دقة الخلية الواحدة لمجموعات الخلايا بكميات كبيرة في وقت واحد. لا يوفر تصوير مجموعات الخلايا الموسومة بالفلورسنت في أدمغة واضحة دقة متشابكة ولكنه يسمح بتوصيف شامل للتفاعلات المكانية بين الخلايا النجمية ومجموعة متنوعة من أنواع الخلايا العصبية.
لهذا السبب، قمنا بتسخير هذه التقنيات الحديثة للتحقيق في خصائص الخلايا النجمية في جميع أنحاء CA1 الظهرية، وتصوير جميع الصفيحات (Stratum Radiatum، الطبقة الهرمية، و Stratum Oriens). قمنا بقياس عشرات الآلاف من الخلايا النجمية (مع اختراق فيروسي بنسبة >96٪ 5) ، وبالتالي تحليل معلومات جميع سكان الخلايا النجمية حول CA1. مع الاختراق الفعال للعلامات العصبية ، يمكننا تسجيل التفاعلات بين جميع سكان الخلايا النجمية CA1 والأنواع الأربعة من الخلايا العصبية – بارفالبومين (PV) ، السوماتوستاتين (SST) ، الخلايا العصبية المثبطة VIP ، والخلايا الهرمية المثيرة9.
تم إجراء العديد من التجارب باستخدام مزيج من التألق من TG وناقلات فيروسية مختلفة الألوان (جميع الخلايا المثبطة) ، في حين استخدمت تجارب أخرى (مثيرة) ناقلين فيروسيين يعبران عن فلوروفورات مختلفة تحت مروجين مختلفين9. تقدم هذه الورقة بروتوكولا مفصلا ، بما في ذلك وضع علامات على الخلايا المرغوبة في الدماغ ، مما يجعل الدماغ شفافا باستخدام إجراء CLARITY المعدل ، بالإضافة إلى تصوير وتحليل هياكل الدماغ الكاملة ، باستخدام العديد من الإجراءات والبرمجيات.
Protocol
Representative Results
Discussion
تقدم طرق تطهير الأنسجة أداة ثورية في أبحاث الدماغ ، مما يدعو إلى أسئلة لم يكن من الممكن طرحها من قبل. من استهداف خصائص مجموعة صغيرة من الخلايا أو خلية واحدة أو حتى مشبك واحد ، يتيح CLARITY الآن استهداف إجمالي عدد الخلايا أو ميزات الاتصال بعيدة المدى باستخدام الفلوروفورات ذات الصلة.
<p class="jove_co…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تلقى هذا المشروع تمويلا من مجلس البحوث الأوروبي (ERC) في إطار برنامج أفق 2020 للبحث والابتكار التابع للاتحاد الأوروبي (اتفاقية المنحة رقم 803589)، ومؤسسة العلوم الإسرائيلية (منحة ISF رقم 1815/18)، والمنح الكندية الإسرائيلية (CIHR-ISF، المنحة رقم 2591/18). نشكر نيشاما نوفيك على تعليقه على المخطوطة بأكملها.
Materials
| AAV1-GFAP::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect astrocytes | |
| AAV5-CaMKII::eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| AAV5-CaMKII::H2B-eGFP | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neuronal nuclei | |
| AAV5-CaMKII::TdTomato | ELSC Vector Core Facility (EVCF) | viral vector used to detect neurons | |
| Acrylamide (40%) | Bio-rad | #161-0140 | |
| Bisacrylamide (2%) | Bio-rad | #161-0142 | |
| Boric acid | Sigma | #B7901 | Molecular weight – 61.83 g/mol |
| Confocal microscope, scanning, FV1000 | Olympus | 4x objective (UPlanSApo, 0.16 NA) | |
| Imaris software | Bitplane, UK | A software that allows 3D analysis of images | |
| NaOH | Sigma | #S5881 | |
| PBS | |||
| PFA 4% | EMS | #15710 | |
| RapiClear | SunJin lab | #RC147002 | |
| RapiClear CS | SunJin lab | #RCCS002 | |
| SDS | Sigma | #L3771 | |
| SyGlass software | A software that allows 3D analysis of images using virtual reality | ||
| Tris base 1 M | Bio-rad | #002009239100 | Molecular weight – 121.14 g/mol |
| Triton X-100 | ChemCruz | #sc-29112A | |
| Two photon microscope | Neurolabware | Ti:sapphire laser (Chameleon Discovery TPC, Coherent), GaAsP photo-multiplier tubes (Hamamatsu, H10770-40) , bandpass filter (Semrock), water immersion 16x objective (Nikon, 0.8 NA) | |
| VA-044 Initiator | Wako | #011-19365 |
Referências
- Perea, G., Navarrete, M., Araque, A. Tripartite synapses: astrocytes process and control synaptic information. Trends in Neurosciences. 32 (8), 421-431 (2009).
- Ciappelloni, S., et al. Aquaporin-4 surface trafficking regulates astrocytic process motility and synaptic activity in health and autoimmune disease. Cell Reports. 27 (13), 3860-3872 (2019).
- Sylvain, N. J., et al. The effects of trifluoperazine on brain edema, aquaporin-4 expression and metabolic markers during the acute phase of stroke using photothrombotic mouse model. Biochimica et Biophysica Acta. Biomembranes. 1863 (5), 183573 (2021).
- Kitchen, P., et al. Targeting aquaporin-4 subcellular localization to treat central nervous system edema. Cell. 181 (4), 784-799 (2020).
- Adamsky, A., et al. Astrocytic activation generates de novo neuronal potentiation and memory enhancement. Cell. 174 (1), 59-71 (2018).
- Adamsky, A., Goshen, I. Astrocytes in memory function: pioneering findings and future directions. Neurociência. 370, 14-26 (2018).
- Nagai, J., et al. Behaviorally consequential astrocytic regulation of neural circuits. Neuron. 109 (4), 576-596 (2021).
- Clavreul, S., et al. Cortical astrocytes develop in a plastic manner at both clonal and cellular levels. Nature Communications. 10 (1), 4884 (2019).
- Refaeli, R., et al. Features of hippocampal astrocytic domains and their spatial relation to excitatory and inhibitory neurons. Glia. 69 (10), 2378-2390 (2021).
- Eilam, R., Aharoni, R., Arnon, R., Malach, R. Astrocyte morphology is confined by cortical functional boundaries in mammals ranging from mice to human. eLife. 5, 15915 (2016).
- Bushong, E. A., Marton, M. E., Ellisman, M. H. Maturation of astrocyte morphology and the establishment of astrocyte domains during postnatal hippocampal development. International Journal of Developmental Neuroscience. 22 (2), 73-86 (2004).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Ellisman, M. H. Examination of the relationship between astrocyte morphology and laminar boundaries in the molecular layer of adult dentate gyrus. Journal of Comparative Neurology. 462 (2), 241-251 (2003).
- Bushong, E. A., Martone, M. E., Jones, Y. Z., Ellisman, M. H. Protoplasmic astrocytes in CA1 stratum radiatum occupy separate anatomical domains. The Journal of Neuroscience. 22 (1), 183-192 (2002).
- Chai, H., et al. Neural circuit-specialized astrocytes: transcriptomic, proteomic, morphological, and functional evidence. Neuron. 95 (3), 531-549 (2017).
- Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71 (6), 995-1013 (2011).
- Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biology. 3 (5), 159 (2005).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- DeNardo, L. A., et al. Temporal evolution of cortical ensembles promoting remote memory retrieval. Nature Neuroscience. 22 (3), 460-469 (2019).
- Srinivasan, R., et al. New transgenic mouse lines for selectively targeting astrocytes and studying calcium signals in astrocyte processes in situ and in vivo. Neuron. 92 (6), 1181-1195 (2016).
- Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
- Ye, L., et al. Wiring and molecular features of prefrontal ensembles representing distinct experiences. Cell. 165 (7), 1776-1788 (2016).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nature Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
