近年、アストロサイト機能とそれらがニューロン回路とどのように相互作用するかについての知識は劇的に増加しています。アストロサイトは可塑性^1,2に影響を与え、ニューロンの損傷後の回復を補助し^3,4、さらにはde novoニューロン増強を誘導することができ、最近の研究では、以前は純粋にニューロン機能と考えられていた記憶獲得と報酬におけるアストロサイトの重要性が示されている^5,6,7.アストロサイト研究において特に興味深い特徴は、海馬および他の脳構造におけるユニークな空間組織を維持する細胞の空間配置である^8,9,10。細胞体腫の間で絡み合うニューロン樹状突起とは異なり、海馬アストロサイトは、そのプロセスの間にわずかに重複して視覚的に区別可能な領域に生息し、別個のドメイン^{8、11、12、13}を作り出す。ニューロン回路へのアストロサイトの関与を支持する証拠は、そのような集団およびそれらのドメイン内のニューロンの詳細な解剖学的記述の欠如を支持しない¹⁴。

ウイルスベクター形質導入手順は、トランスジェニック動物(TG)とともに、脳の構造、機能、および細胞相互作用を調査するためのツールセットとして普及している^15,16。異なるプロモーターの利用は、それらの遺伝的特性、活性化レベル¹⁷、¹⁸、または投影標的に応じた特定の細胞の標的化を可能にする。異なるウイルスは、異なる集団で異なる色の蛍光色素を発現することができる。ウイルスは、TGにおける蛍光色素の内因性発現と組み合わせることができ、またはTG動物をウイルスを必要とせずに使用することができる。これらの技術はニューロンマーキングに広く使用されており、一部の研究室では、アストロサイト⁵、^9、19などの他の細胞型を標的とすることに特化した修飾でそれらを使用し始めています。

2013^20,21で最初に記述されたCLARITY^{技術は、微}視的構造をそのまま残しながら脳全体を透明にすることによって、厚い脳スライスの研究を可能にする。ウイルスベクター形質導入と組織クリアリングの2つの方法を組み合わせることで、異なる細胞型集団間の空間的相互作用を調べるオプションが利用可能になりました。ほとんどのアストロサイト-ニューロン相互作用研究は、薄い脳スライスに対して実施され、その結果、ドメインが大きいために不完全なアストロサイトの画像が得られ、分析された細胞の数が根本的に制限された。CLARITY技術を使用することで、大規模ボリューム内の細胞集団の単一セル分解能特性評価を同時に行うことができます。明瞭な脳内の蛍光タグ付き細胞集団をイメージングしてもシナプス分解能は得られませんが、アストロサイトとさまざまなニューロン細胞タイプとの間の空間的相互作用の徹底的な特徴付けが可能になります。

そのため、これらの最先端の技術を利用して、背側CA1全体のアストロサイトの特性を調査し、すべての薄層(ラディアタム層、ピラミッド層、オリエンス層)をイメージングしました。我々は数万のアストロサイト(ウイルス浸透度>96%⁵)を測定し、CA1周辺のアストロサイト集団全体の情報を解析した。ニューロンマーカーの効率的な浸透により、CA1アストロサイトの集団全体と、パルブアルブミン(PV)、ソマトスタチン(SST)、VIP阻害性ニューロン、および興奮性錐体細胞の4種類のニューロン細胞との間の相互作用を記録することができました⁹。

TG動物からの蛍光と異なる色のウイルスベクター(すべての阻害細胞)の組み合わせを用いていくつかの実験を実施し、一方、他の実験(興奮性)は、異なるプロモーター下で異なる蛍光団を発現する2つのウイルスベクターを利用した⁹。この論文では、脳内の所望の細胞のタグ付け、修正されたCLARITY手順を使用して脳を透明にすること、および様々な手順およびソフトウェアを使用して完全な脳構造を画像化および分析することを含む詳細なプロトコルを提示する。