마우스 뇌 절편에 대한 아밀로이드-베타 부하의 전체 대 하위 지역 정량화
Summary
본 프로토콜은 알츠하이머병의 APP/PS1 트랜스제닉 마우스 모델에서 아밀로이드-베타 부하를 정량화하기 위해 시상 마우스 뇌 절편의 전체 영역 또는 관심 영역 분석을 수행하는 절차를 설명하고 비교한다.
Abstract
아밀로이드 베타 (Aβ) 플라크의 세포외 축적은 알츠하이머 병 (AD)의 주요 병리학 적 특징 중 하나이며, AD에 대한 FDA 승인 질병 변형 치료의 유일한 표적입니다. 따라서, 아밀로이드 전구체 단백질을 과발현시키고 이로 인해 대뇌 Aβ 플라크를 축적시키는 트랜스제닉 마우스 모델의 사용은 마우스에서 인간 AD를 모델링하는 데 널리 사용됩니다. 따라서, 효소-결합 면역흡착 분석법(ELISA) 및 면역염색을 포함하는 면역검정은 일반적으로 AD 형질전환 마우스로부터 유래된 뇌 조직에서 Aβ 부하를 측정한다. Aβ 검출 및 정량화를 위한 방법이 잘 확립되고 문서화되었지만, 면역염색 후 Aβ 부하 측정에 대한 뇌 조직에서 선택된 관심 영역의 크기가 미치는 영향은 보고되지 않았다. 따라서, 현재의 프로토콜은 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 관심 있는 전체 및 하위 영역에 걸친 Aβ 부하 측정치를 비교하는 것을 목표로 한다. 뇌 조직 준비, 자유 부유 뇌 섹션 면역염색, 이미징 및 관심있는 전체 대 하위 영역에서 Aβ 부하의 정량화에 관련된 단계는 13 개월 된 APP / PS1 이중 트랜스제닉 수컷 마우스에서 파생 된 뇌 섹션을 사용하여 설명됩니다. 현재의 프로토콜과 결과는 관심있는 영역의 크기가 Aβ 양성 영역 정량화에 미치는 영향에 대한 귀중한 정보를 제공하고, 광범위한 Aβ 침착을 보여주는 13 개월 된 수컷 APP / PS1 마우스에서 파생 된 뇌 절편에 대한 관심 영역의 전체 및 하위 영역 분석을 사용하여 얻은 Aβ 양성 영역 사이의 강한 상관 관계를 보여줍니다.
Introduction
미국에서 여섯 번째로 큰 사망 원인 인 알츠하이머 병 (AD)은 공중 보건의 위협으로 계속 남아 있으며 약 6.2 만 명의 미국인이 AD와 함께 살고 있습니다. 이것은 2060 년까지 13.8 백만에 도달 할 것으로 예상됩니다1. 현재까지 콜린에스테라제 억제제 및 메만틴과 같은 약물을 통한 증상 관리는 치료2의 주요 과정입니다. AD는 아밀로이드-베타 (Aβ) 플라크의 세포외 침착 및 신경세동 엉킴 3,4의 형태로 세포내 과인산화된 타우 축적과 같은 신경병리학적 징후를 특징으로 한다. 베타- 및 감마 세크레타제를 통한 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)의 내프로테롤리드 절단에 의해 형성되고, Aβ 응집체는 올리고머 및 피브릴을 형성하여, 신경독성 효과5를 유도한다. Aβ는 1980년대부터 일차적인 병리학적 역할을 하는 것으로 가설되어 왔으며, AD6에 대한 유일한 FDA 승인 질환 변형 요법의 치료 표적이다. 그 결과, 강력한 뇌 Aβ 축적을 초래하는 유전자에 돌연변이를 보유하는 형질전환 AD 마우스 모델은 1990년대 초반부터 전임상 AD 연구에 널리 사용되어왔다 7.
이러한 AD 트랜스제닉 마우스 뇌에서 Aβ 종의 검출은 일반적으로 두 가지 면역검정, 즉 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)과 면역염색을 사용하여 수행된다. 이전 분석은 상이한 Aβ 종의 정량적 결정을 가능하게 하고, 면역염색에 비해 시간이 덜 소요되며, 이는 조직 절편화, 면역염색, 이미징 및 정량화를 포함하는 여러 순차적 조직 처리 및 이미징 단계를 필요로 한다8. 또한, 면역염색 후 얻어진 결과는 반정량적8이다. 그러나, Aβ를 공간적으로 국소화하는 능력은 면역염색을 뇌 조직에서의 Aβ 검출을 위한 매력적인 접근법으로 만든다8.
Aβ 면역염색을 사용하는 동안, 몇몇 상이한 정량화 패러다임이 상이한 연구 그룹에 의해 이용되었다. 예를 들어, 일부 연구 그룹은 관심 영역 (피질 또는 해마)의 전체 Aβ 부하를 정량화하는 반면, 다른 연구 그룹은 지정된 관심 하위 영역 (피질 또는 해마의 일부)에서 Aβ 부하를 정량화합니다 9,10,11. Aβ 검출 및 정량화를 위한 방법들이 잘 확립되고 문서화되었지만, 면역염색 후 Aβ 부하 측정에 대한 관심 영역의 크기의 영향은 보고되지 않았다. 따라서, 현재의 프로토콜은 이미지 분석 소프트웨어인 ImageJ를 사용하여 관심 있는 전체 및 하위 영역에 걸친 Aβ 부하 측정치를 비교하는 것을 목표로 한다.
현재의 연구는 AD12의 조기 발병을 모델링하기 위해 키메라 마우스 / 인간 APP와 돌연변이 프레세닐린 1을 발현하는 13 개월 된 APP / PS1 이중 트랜스제닉 남성 마우스를 사용했습니다. Aβ 침착물은 생후 6-7개월에 의해 발달하기 시작하고, 풍부한 Aβ 축적은12세의 9-10개월에 의해 이들 마우스의 피질과 해마 모두에서 관찰된다. 트랜스제닉 아밀로이드 펩티드 및 홀로단백질은 6E10-면역염색13에 의해 검출될 수 있어, 본 프로토콜에 대한 바람직한 동물 모델이 된다. 본원에 다룬 절차는 뇌 조직 준비, 자유 부유 절편의 면역염색, 영상화, 및 관심의 전체 대 하위-영역에서의 Aβ 부하의 정량화를 포함한다. 이 분석은 전체 및 하위 지역 정량화 사이의 강한 상관 관계를 보여 주며, 풍부한 Aβ 침착을 보여주는 13 개월 된 APP / PS1 수컷 마우스에서 파생 된 뇌 조직 절편에서이 두 가지 방법 간의 강력한 일치를 나타냅니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
본원에 기재된 프로토콜은 시상 절편화를 위한 반-뇌 제제, 자유 부유 절편 상의 6E10 항체를 이용한 Aβ 침착물의 면역형광 염색, Aβ 염색된 뇌 절편의 영상화, 이어서 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 마우스 뇌 조직의 피질 및 해마에서의 Aβ 침착물의 정량화를 위한 절차를 개략적으로 설명한다. 뇌 조직 절편 8,10에서 Aβ 부하를 정량화하기 위한 공개된 프로토콜이 있지만, 이 프로토콜은 이것이 요망될 수 있을 때, 피질 및 해마에서 관심있는 서브 영역에서의 Aβ 부하와 비교하여 전체 이소피질(피질로 지칭됨) 및 해마에서 Aβ 부하의 정량화에 관여하는 단계들을 기술한다. 관심 분석의 전체 영역과 하위 영역 간의 상관 관계도 제공됩니다.
프로토콜에는 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 먼저, 기술된 프로토콜은 20 μm 두께의 뇌 조직 절편에 대해 자유 부유 면역염색을 실시하고, 이는 조직 섹션(18) 내에서 최적의 항체 침투를 초래한다. 자유-부유 기술은 조직 절편이 면역형광 염색 동안 상이한 용액들 사이에서 수동으로 전달될 것을 요구하고, 절차 전반에 걸쳐 조직 절편의 신중한 취급을 요구할 수 있다. 이것은 조직 절편이 현재의 프로토콜에서 항원 검색을 위해 70% 포름산 용액에 침지될 때 특히 중요하며, 얇은 절편에 대한 조직 취약성을 증가시킨다. 기술된 프로토콜에 대한 대안적인 접근법은 더 두꺼운 조직 절편(예를 들어, 30-40 μm)을 사용하거나 면역형광 염색 전에 양전하를 띤 슬라이드 상에 직접 장착되는 조직 절편을 사용하는 것을 포함한다. 둘째, 본원에 기재된 프로토콜은 형광 표지된 6E10 항체를 사용한다. 형광 표지된 6E10 항체를 사용하는 것 외에, 비형광성 6E10 항체 (예를 들어, 양고추냉이 퍼옥시다제-접합된 6E10 항체)는 또한 뇌 조직 절편에서 Aβ 부하를 검출하는데 사용될 수 있고, 현재의 프로토콜은 앞서 기술된 바와 같이 뇌 조직 절편에서 Aβ 양성 면역화학적 염색을 정량화하도록 적응될 수 있다8 . 셋째, Aβ 부하 정량화에 대한 결과의 정확도는 분석 소프트웨어에서 적절한 역치 선택에 의존하며, 이는 조직 배경 및 신호 강도에 의존한다. 역치 선택은 정량화를 위해 Aβ 양성 염색만 선택되도록 최종 사용자에 의해 수행되어야 한다. 임계값 설정의 정확성을 보장하기 위해 모든 이미지에 적용할 수 있는 특정 임계값을 최적화하려면 최종 사용자의 개입이 필요합니다. 넷째, 관심 하위영역 분석에서는 조직 절편에서 작은 관심 영역을 선택해야 하기 때문에, 이 분석에 두 개의 독립적인 리더가 사용되었다. 데이터 수집 중에 독립성과 블라인드를 유지하기 위해 모든 이미지는 번호가 코드화되었습니다. 이미지 분석 시퀀스는 독자간에 무작위화되어 서로 다른 독자가 주어진 시간에 다른 이미지를 분석하고 매주 말에 데이터를 제출했습니다. 관심 하위 영역 분석에서 관심 영역 선택에서 리더 간 변동성의 가능성이 증가했기 때문에 독자는 데이터 수집을 시작하기 전에 피질과 해마에서 영역 선택을 최적화하기 위해 여러 샘플 이미지를 사용하여 훈련되었습니다. 이 훈련은 독자 간 변동성을 줄이는 데 중요하며, 볼 수 있듯이 (그림 5A, B), 두 독자가 보고한 6E10 양성 영역은 현재 연구에서 강한 상대적 일치를 보여줍니다.
현재의 프로토콜 및 결과는 Aβ 양성 영역 정량화에 대한 관심 영역 크기의 영향에 대한 귀중한 정보를 제공한다. 더 큰 관심 영역은 더 작은 관심 영역보다 더 많은 조직을 나타낼 것으로 예상된다. 따라서, 더 큰 조직을 샘플링하는 것은 조직 내의 Aβ 부하를 정확하게 정량화하는 것이 바람직하다. 그러나, 조직 내의 균질한 Aβ 부하 분포의 경우에, 더 작은 샘플링 영역은 일반적으로 분석하에 더 큰 조직의 양호한 표현으로 간주된다. 현재의 연구 결과는 이것을 확인하고, 전체 피질과 해마에서의 Aβ 하중은 피질과 해마의 선택된 하위영역에서 Aβ 부하의 강한 상관관계를 가졌다(도 5C, D). 관심 분석의 전체 영역과 하위 영역 간의 일치를 더 확인하기 위해 피질과 해마의 평균 6E10 양성 영역을 비교했으며 두 방법 간의 차이는 발견되지 않았습니다 (그림 5E). 이는 이들 방법 중 하나(전체 또는 하위 영역 분석)가 필적할만한 Aβ 부하 측정을 산출한다는 것을 확인시켜 준다.
현재 프로토콜에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 두 가지 방법(전체 영역 대 하위 영역 분석)이 항상 상호 교환적으로 사용되는 것은 아닙니다. 전체 또는 하위영역 분석을 사용하는 선택은 조직 내 Aβ의 지역적 분포에 의존할 것이며, 이는 AD 마우스 모델의 연령, 성별 및 균주에 의해 영향을 받는다. 13개월에 Aβ 하중은 APP/PS1 마우스의 피질과 해마 전체에 분포한다. 그러나, 6개월에, Aβ 침착물은 피질로 제한되고, 해마(12)에서 최소 퇴적물이 관찰된다. 이러한 조건 하에서, 전체 관심 영역 분석은 조직 샘플링 영역을 증가시키고 이에 따라 Aβ 신호를 증가시키는 바람직한 접근법일 수 있다. 한편, 서브-영역 분석은 특정 뇌 영역(예를 들어, 체감각 피질)에 Aβ 부하가 관심 있는 경우에 선택되는 방법일 수 있다. 또한 13 개월에 APP / PS1 수컷 마우스는 강렬한 6E10 양성 염색을 보여 주며 면역 형광 염색은 매우 낮은 배경으로 우수한 신호를 생성하므로 현재 프로토콜은 주어진 조건 하에서 정량화에 매우 적합합니다. 이 정량화 방법이 덜 강렬한 염색에 성공적으로 적용될 수 있는지는 불분명하며,이 질문에 답하기 위해서는 앞으로의 연구가 필요할 것입니다. 본원에 제시된 면역형광 및 이미지 정량 방법은 전구체 형태13을 포함하는 모든 형태의 Aβ를 검출한다. 결과적으로, 특정 Aβ 스펙 (예를 들어, Aβ1-40 또는 Aβ1-42)의 검출에 관심이 있다면, 이들 Aβ 이소형에 특이적인 항체가 사용될 수 있다. 따라서 6E10 면역형광 염색 및 검출 방법이 ELISA를 이용한 전뇌 균질액에서의 Aβ1-42 측정치의 측정치와 상관관계가 있음에도 불구하고(도 5F, G), 상관관계는 미미할 뿐이었다. 이는 ELISA를 이용한 Aβ1-42만을 측정하고 6E10 면역염색을 이용한 모든 Aβ 종의 검출에 기인할 수 있다. 현재 연구는 세 명의 독자를 사용하여 전체 및 하위 지역 분석 간의 합의와 상관 관계를 평가합니다. 추가 독자를 확보하면 연구의 견고성이 향상 될 수 있으며 여기에 제시된 두 가지 방법 간의 합의를 더욱 검증 할 수 있습니다. 또한, 우리는 Pearson 상관 관계를 합의의 척도로 사용하며, 이는 연속 변수19 간의 합의를 설명하기 위해 다른 방법들 사이에서 널리 사용됩니다. 그러나, Pearson 상관관계를 사용하여 합의를 결정하는 한 가지 한계는 여기에 사용된 두 가지 방법이 관련 결과를 제공할 수 있지만, 한 방법은 체계적인 편향으로 인해 다른 방법보다 전반적으로 더 높은 값을 초래할 수 있다는 것이다. 따라서 피어슨 상관관계는 상대적 합의(19)의 좋은 척도이다. 프로토콜의 견고성을 높이기 위해, 두 가지 방법으로 평균 6E10 양성 영역을 비교하는 것과 같은 절대 일치를 확인하기 위한 추가적인 방법(그림 5E)이 사용될 수 있다(도 5E). 종합하면, 현재의 프로토콜은 면역형광 염색에 의해 검출된 Aβ 부하를 비교하고, 뇌 조직 절편에서 관심있는 전체 및 하위영역을 분석한다. 결과는 풍부한 Aβ 침착을 보여주는 13 개월 된 APP / PS1 수컷 마우스에서 파생 된 뇌 조직 절편에 대한이 두 가지 방법 사이의 강한 상관 관계를 보여줍니다.
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 간행물에보고 된 연구는 수상 번호 R01AG062840 (RKS에) 및 R01AG072896 (RKS로)으로 국립 보건원 국립 노화 연구소의 지원을 받았다. 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 공식 견해를 나타내는 것은 아닙니다. 연방 기금의 약 $ 200k (100 %)가이 프로젝트를 지원했습니다. 우리는 또한 원고 편집에 도움을 주신 Joshua Yang 박사에게 감사드립니다.
Materials
| 15 mL conical tubes | ThermoFisher Scientific, MA, USA | 339650 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/339650 |
| 24-well plates | Fisher Scientific, NH, USA | FB012929 | https://www.fishersci.com/shop/products/jet-biofil-surface-treated-steriletissue-culture-plates-3/FB012929 |
| Amyloid beta 42 human ELISA kit | ThermoFisher Scientific, MA, USA | KHB3441 | https://www.thermofisher.com/elisa/product/Amyloid-beta-42-Human-ELISA-Kit/KHB3441 |
| Aqueous mounting media | Vector laboratories, CA, USA | H-5501-60 | https://vectorlabs.com/products/mounting/vectamount-aq-aqueous-mounting-medium |
| Bovine serum albumin | Sigmaaldrich, MO, USA | A2153-50G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a2153?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSiZ9B3YGz3RvSpWqCH4CPW78 Dj4WlgxmzPs631z5IHmy5XLV TdC_jBoC9zQQAvD_BwE |
| BZ-X710 Keyence all-in-one fluorescence microscope | Keyence, IL, USA | BZ-X710 | https://www.keyence.com/products/microscope/fluorescence-microscope/bz-x700/models/bz-x710/ |
| Clear nail poilsh | User preference | NA | None |
| Cryostat | Leica Biosystems, IL, USA | Leica CM1860 Cryostat | https://www.leicabiosystems.com/us/histology-equipment/cryostats/leica-cm1860/ |
| Formic acid | Sigmaaldrich, MO, USA | F0507-500ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigald/f0507?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TSheH6JMGnla50C3Ag0cLzXE8 BObxvDApl0udjYAPZmBGe7a 8PRUv1RoCt34QAvD_BwE |
| Glass coverslips | VWR, PA, USA | 48393-081 | https://us.vwr.com/store/product/4645817/vwr-micro-cover-glasses-rectangular |
| GraphPad Prism | GraphPad Software, CA, USA | Version 8 | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ |
| ImageJ 1.51k | National Institutes of Health, MD, USA | Version 1.53e | https://imagej.nih.gov/ij/download.html |
| Mice | Jackson Laboratories, ME, USA | 034829-JAX | https://www.mmrrc.org/catalog/sds.php?mmrrc_id=34829 |
| Paraformaldehyde | Sigmaaldrich, MO, USA | P6148-500G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/p6148?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_G TShtLb9Ax9MmRyrFn6Rfmmg 1l52_5XZFXOeXT24ik8Lkw GH7fvlDoHBoChzYQAvD_BwE |
| Phenytoin/pentobarbital based anesthetic (Euthasol) | Patterson Veterinary, MA, USA | 07-805-9296 | https://www.pattersonvet.com/Supplies/ProductFamilyDetails/PIF_32818 |
| Phosphate-buffered saline | Fisher Scientific, NH, USA | BP661-50 | https://www.fishersci.com/shop/products/pbs-1x-powder-concentrate-white-granular-powder-fisher-bioreagents-2/BP66150 |
| Plus (+) microscope slides | Ted Pella, Inc., CA, USA | 260100 | https://www.tedpella.com/histo_html/slides.htm#260384 |
| Primary antibody (6E10) | Biolegend, CA, USA | 803013 | https://www.biolegend.com/en-us/products/alexa-fluor-488-anti-beta-amyloid-1-16-antibody-10833 |
| Sucrose | Sigmaaldrich, MO, USA | 47289 | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/supelco/47289?gclid=CjwKCAjw9aiIBhA1EiwAJ_ GTSuwlymWL_PUl2KIMHymi GLOWluZdPjf3pRcjMEjQD siItfWiG-C2-RoCxyoQAvD_BwE |
| Triton X 100 | Sigmaaldrich, MO, USA | T8787-100ML | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8787?context=product |
Referências
- Alzheimer’s Association. 2021 Alzheimer’s disease facts and figures. Alzheimer’s & Dementia. 17 (3), 327-406 (2021).
- Langa, K. M., Foster, N. L., Larson, E. B. Mixed dementia: emerging concepts and therapeutic implications. Journal of the American Medical Association. 292 (23), 2901-2908 (2004).
- Gandy, S., DeKosky, S. T. Toward the treatment and prevention of Alzheimer’s disease: rational strategies and recent progress. Annual Review of Medicine. 64, 367-383 (2013).
- Bloom, G. S. Amyloid-beta and tau: the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis. JAMA Neurology. 71 (4), 505-508 (2014).
- Gremer, L., et al. Fibril structure of amyloid-beta(1-42) by cryo-electron microscopy. Science. 358 (6359), 116-119 (2017).
- Ferrero, J., et al. First-in-human, double-blind, placebo-controlled, single-dose escalation study of aducanumab (BIIB037) in mild-to-moderate Alzheimer’s disease. Alzheimer’s & Dementia Translational Research & Clinical Interventions. 2 (3), 169-176 (2016).
- Poon, C. H., Wang, Y., Fung, M. L., Zhang, C., Lim, L. W. Rodent models of amyloid-beta feature of Alzheimer’s disease: development and potential treatment implications. Aging and Disease. 11 (5), 1235-1259 (2020).
- Christensen, A., Pike, C. J. Staining and quantification of beta-amyloid pathology in transgenic mouse models of Alzheimer’s disease. Methods in Molecular Biology. 2144, 221 (2020).
- Thakker, D. R., et al. Intracerebroventricular amyloid-beta antibodies reduce cerebral amyloid angiopathy and associated micro-hemorrhages in aged Tg2576 mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (11), 4501-4506 (2009).
- Song, Z., et al. Detecting amyloid-beta accumulation via immunofluorescent staining in a mouse model of Alzheimer’s disease. Journal of Visualized Experiments. (170), e62254 (2021).
- Sun, J., et al. Hematologic safety of chronic brain-penetrating erythropoietin dosing in APP/PS1 mice. Alzheimer’s & DementiaTranslational Research & Clinical Interventions. 5, 627-636 (2019).
- Jankowsky, J. L., et al. Mutant presenilins specifically elevate the levels of the 42 residue beta-amyloid peptide in vivo: evidence for augmentation of a 42-specific gamma secretase. Human Molecular Genetics. 13 (2), 159-170 (2004).
- Grant, M. K. O., et al. Human cerebrospinal fluid 6E10-immunoreactive protein species contain amyloid precursor protein fragments. PloS One. 14 (2), 0212815 (2019).
- Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. Whole animal perfusion fixation for rodents. Journal of Visualized Experiments. (65), e3564 (2012).
- Eichenbaum, K. D., et al. Minimally invasive method for murine brain fixation. Biotechniques. 39 (4), 487-490 (2005).
- Chang, R., et al. Blood-brain barrier penetrating biologic tnf-alpha inhibitor for Alzheimer’s disease. Molecular Pharmaceutics. 14 (7), 2340-2349 (2017).
- Pinskiy, V., et al. High-throughput method of whole-brain sectioning, using the tape-transfer technique. PloS One. 10 (7), 0102363 (2015).
- Potts, E. M., Coppotelli, G., Ross, J. M. Histological-based stainings using free-floating tissue sections. Journal of Visualized Experiments. (162), e61622 (2020).
- van Stralen, K. J., Dekker, F. W., Zoccali, C., Jager, K. J. Measuring agreement, more complicated than it seems. Nephron Clinical Practice. 120 (3), 162-167 (2012).
