Mevcut protokol, geliştirilmiş bir tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi kullanarak protein fosforilasyonunu ölçmek için numune hazırlama ve veri analizini açıklamaktadır.
Fosforilasyon, protein fonksiyonunu düzenleyen ve hücre sinyal sonuçlarını yönlendiren gerekli bir posttranslasyonel modifikasyondur. Protein fosforilasyonunu ölçmek için mevcut yöntemler, tek tek proteinler arasında fosforilasyondaki heterojenliği koruyamaz. Tek moleküllü pull-down (SiMPull) testi, makromoleküler komplekslerin bileşimini, proteinlerin bir cam kapak kapağı üzerindeki immünopresipitasyonu ve ardından tek moleküllü görüntüleme yoluyla araştırmak için geliştirilmiştir. Mevcut teknik, tek molekül seviyesinde tam uzunluktaki membran reseptörlerinin fosforilasyon durumunun sağlam bir şekilde ölçülmesini sağlayan SiMPull’un bir uyarlamasıdır. Binlerce bireysel reseptörün bu şekilde görüntülenmesi, protein fosforilasyon paternlerinin ölçülmesine izin verir. Mevcut protokol, numune hazırlamadan görüntülemeye kadar optimize edilmiş SiMPull prosedürünü detaylandırır. Cam hazırlama ve antikor fiksasyon protokollerinin optimizasyonu veri kalitesini daha da artırır. Mevcut protokol, bir numune içinde fosforile edilen reseptörlerin fraksiyonunu hesaplayan tek moleküllü veri analizi için kod sağlar. Bu çalışma epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) fosforilasyonuna odaklanırken, protokol diğer membran reseptörlerine ve sitozolik sinyal moleküllerine genelleştirilebilir.
Membranla ilişkili sinyalleşme, ligand kaynaklı membran reseptör aktivasyonu ve sinyali yayan aşağı akış aksesuar proteinlerinin işe alınmasının bir kombinasyonu ile ayarlanır. Reseptör sitoplazmik kuyruklarındaki anahtar tirozinlerin fosforilasyonu, sinyal komplekslerinin veya sinyalozomların oluşumunu başlatmak için kritik öneme sahiptir 1,2. Bu nedenle, biyolojide önemli bir soru, sinyal ortaklarını işe almak ve hücresel sonuçları dikte etmek için fosforilasyon modellerinin nasıl oluşturulduğu ve sürdürüldüğüdür. Bu, reseptör fosforilasyonunun heterojenliğini, hem bol miktarda hem de sinyalozom 3,4,5,6,7’nin bileşimini dikte ederek sinyal çıkışlarını manipüle etmenin bir yolunu sağlayabilen spesifik fosfotirozin modellerinde anlamayı içerir. Bununla birlikte, protein fosforilasyonunu sorgulamak için mevcut yöntemlerde sınırlamalar vardır. Batı leke analizi, protein fosforilasyon eğilimlerini tanımlamak için mükemmeldir, ancak yarı kantitatif8’dir ve sistemin heterojenliği hakkında bilgi sağlamaz, çünkü binlerce ila milyonlarca reseptörün ortalaması birlikte alınır. Batı lekeleri, spesifik tirozinlere fosfo-spesifik antikorlar kullanarak bir numunenin araştırılmasına izin verirken, aynı protein içindeki çok bölgeli fosforilasyon paternleri hakkında bilgi sağlayamazlar. Kantitatif fosfoproteomikler fosfotirozin bolluğu hakkında rapor verir, ancak çok bölgeli fosforilasyonun saptanmasında sınırlamalar vardır, çünkü ilgilenilen kalıntıların enzimatik sindirim9,10,11 tarafından üretilen aynı peptid (tipik olarak 7-35 amino asit) içinde bulunması gerekir.
Yukarıda belirtilen sınırlamaların üstesinden gelmek için, tek moleküllü aşağı çekme (SiMPull) testi, tek moleküllü seviyedeki sağlam reseptörlerin fosforilasyon durumlarını ölçmek için uyarlanmıştır. SiMPull, makromoleküler kompleksleri sorgulamak için güçlü bir araç olarak ilk olarak Jain ve ark.12,13 tarafından gösterilmiştir. SiMPull’da, makromoleküler kompleksler antikor işlevselleştirilmiş cam kapaklar üzerinde immünoprepite edildi (IP) ve daha sonra protein alt birim sayısı ve karmaşık bileşenlerle ko-IP için tek moleküllü mikroskopi ile analiz edildi12. Kim ve ark.14 tarafından SiMBlot olarak adlandırılan bir modifikasyon, denatüre proteinlerin fosforilasyonunu analiz etmek için SiMPull’un bir varyasyonunu kullanan ilk kişi oldu. SiMBlot protokolü, NeutrAvidin kaplı kapaklar kullanılarak biyotinile hücre yüzey proteinlerinin yakalanmasına dayanır ve bunlar daha sonra fosfo-spesifik antikor etiketleme14 ile fosforilasyon için incelenir. Bu ilerlemelere rağmen, posttranslasyonel modifikasyonun nicelleştirilmesini daha sağlam ve daha geniş bir protein yelpazesine uygulanabilir hale getirmek için iyileştirmelere ihtiyaç vardı.
Mevcut protokol, bir dizi ligand koşuluna ve onkojenik mutasyonlara yanıt olarak bozulmamış epidermal büyüme faktörü reseptörünün (EGFR) fosforilasyon paternlerini ölçmek için kullanılan optimize edilmiş bir SiMPull yaklaşımını tanımlamaktadır15. Bu çalışma EGFR’ye odaklanırken, bu yaklaşım, kaliteli antikorların mevcut olduğu herhangi bir membran reseptörü ve sitozolik proteinlere (POI) uygulanabilir. Protokol, numune otofloresansını azaltma adımlarını, 20 numuneye kadar eşzamanlı hazırlık ile minimum numune hacmi gerektiren bir numune dizisi tasarımını ve antikor etiketleme ve sabitleme koşullarının optimizasyonunu içerir. Fosforile proteinlerin tek moleküllü tespiti ve nicelleştirilmesi için veri analiz algoritmaları geliştirilmiştir.
Burada açıklanan protokol, tek protein seviyesinde reseptör fosforilasyonunun kantitatif ölçümlerini sağlamak için optimize edilmiştir. SiMPull protokolünde, NaBH4 tedavisi ile otofloresanın azaltılması ve antikor ayrışmasını önlemek için numunenin son sabitlenmesi de dahil olmak üzere fosfo-tirozin tespiti için ölçümün güvenilirliğini artıran birkaç basit ama önemli değişiklik geliştirilmiştir. Anti-PY antikoru ile kolokalizasyonun hesaplanması için reseptör konumlarını …
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri R35GM126934, R01AI153617 ve R01CA248166 to DSL tarafından desteklenmiştir. EMB, ASERT-IRACDA programı (NIH K12GM088021) ve UNM MARC programı (NIH 2T34GM008751-20) tarafından JAR aracılığıyla desteklenmiştir. NIH P30CA118100 tarafından desteklenen New Mexico Üniversitesi Kapsamlı Kanser Merkezi floresan mikroskobu ortak kaynağını kullanarak minnetle teşekkür ederiz. SiMPull’un orijinal gelişimi bu çalışmaya ilham veren Dr. Ankur Jain ve Taekijip Ha’ya teşekkür etmek istiyoruz.
ES-C mevcut adresi: İmmünodinamik Grubu, Bütünleştirici Kanser İmmünolojisi Laboratuvarı, Kanser Araştırmaları Merkezi, Ulusal Kanser Enstitüsü, Bethesda
1.5 mL microcentrifuge tubes | MTC Bio | C2000 | |
10 mM Tris-HCl pH 7.4 | |||
10 mM Tris-HCl pH 8.0/ 50 mM NaCl | T50 Buffer | ||
100 mm Tissue Culture dish | CELLTREAT | 229620 | Storage of piranha etched glass/arrays |
15 mL conical tube | |||
16% Paraformaldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Hazardous |
50 mL conical tube | Functionalized Glass storage/ KOH reuse | ||
50 mM Tris-HCl pH 7.2/150 mM NaCl | Lysis Buffer Component | ||
60 mm Tissue Culture dish | Corning | 430166 | |
8% Glutaraldehyde Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 16020 | Hazardous |
Acetone (C3H6O) | Millipore Sigma | 270725 | Hazardous |
Alexa Fluor 647 NHS Ester | Thermo Fisher Scientific | A-20006 | |
Animal-Free Recombinant Human EGF | Peprotech | AF-100-15 | |
Anti-Human EGFR (External Domain) – Biotin | Leinco Technologies, Inc | E101 | |
Anti-p-Tyr Antibody (PY99) Alexa Fluor 647 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7020 AF647 | |
Bath-sonicator | Branson | 1200 | |
BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23227 | |
Biotin-PEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 | |
Bovine serum albumin | Gold Biotechnology | A-420-1 | Tyrode's Buffer Component |
Buchner funnel | |||
Bunsen burner | |||
Calcium Chloride (CaCl2) | Millipore Sigma | C4901 | Tyrode's Buffer Component |
Cell Scraper | Bioworld | 30900017-1 | |
Conical Filtering Flask | Fisher Scientific | S15464 | |
Coplin Jar | WHEATON | 900470 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
Coverslips 24 x 60 #1.5 | Electron Microscopy Sciences | 63793 | |
DipImage | https://diplib.org/ | ||
DMEM | Caisson Labs | DML19-500 | |
emCCD camera | Andor iXon | ||
Fetal Bovine Serum, Optima | Bio-Techne | S12450H | Heat Inactivated |
Fusion 360 software | Autodesk | ||
Geneticin G418 Disulfate | Caisson Labs | G030-5GM | |
Glacial Acetic Acid (CH3COOH) | JT Baker | JTB-9526-01 | Hazardous |
Glass serological pipettes | |||
Glass Stir Rod | |||
Glucose (D-(+)-Glucose) | Millipore Sigma | D9434 | Tyrode's Buffer Component |
Halt Phosphotase and Protease Inhibitor Cocktail (100X) | Thermo Fisher Scientific | 78446 | Lysis Buffer Component |
HEPES | Millipore Sigma | H3375 | Tyrode's Buffer Component |
Hydrochloric Acid (HCl) | VWR | BDH7204-1 | Hazardous |
Hydrogen Peroxide (H2O2) (3%) | HX0645 | ||
Hydrogen Peroxide (H2O2) (30%) | EMD Millipore | HX0635-2 | |
Ice | |||
IGEPAL CA-630 (NP-40) | Sigma Aldrich | I8896 | Lysis Buffer Component |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
Immersol 518F immersion oil | Zeiss | 444960-0000-000 | |
in-house vacuum line | |||
L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030-164 | |
Magnessium Chloride Hexahydrate (MgCl2-6H2O) | MPBio | 2191421 | Tyrode's Buffer Component |
Matlab | Mathworks | Curve Fitting Toolbox, Parallel Computing Toolbox, and Statistics and Machine Learning toolbox | |
Methanol (CH3OH) | IBIS Scientific | MX0486-1 | Hazardous |
Milli-Q water | |||
Mix-n-Stain CF Dye Antibody Labeling Kits | Biotium | 92245 | Suggested conjugation kit |
mPEG | Laysan Bio | mPEG-succinimidyl valerate, MW 5,000 | |
N-(2-aminoethyl)-3-aminopropyltrimethoxysilane | UCT United Chemical | A0700 | Hazardous |
Nanogrid | Miraloma Tech | ||
NeutrAvidin Biotin Binding Protein | Thermo Fisher Scientific | 31000 | |
Nitrogen (compressed gas) | |||
NVIDIA GPU with CUDA | Look for compatibility at https://www.mathworks.com/help/parallel-computing/gpu-support-by-release.html | ||
Olympus iX71 Microscope | Olympus | ||
Parafilm M Sealing Film | The Lab Depot | HS234526C | |
PBS pH 7.4 | Caisson Labs | PBL06 | |
PC-200 Analog Hot Plate | Corning | 6795-200 | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo Fisher Scientific | 15140-163 | |
Phospho-EGF Receptor (Tyr1068) (1H12) Mouse mAb | Cell Signaling Technology | 2236BF | |
Potassium Chloride (KCl) | Millipore Sigma | 529552 | Tyrode's Buffer Component |
Potassium Hydroxide (KOH) | Millipore Sigma | 1050330500 | Hazardous |
Premium PLA Filament, 1.75 mm diameter | Raise 3D | PMS:2035U/RAL:3028 | Printing temperature range: 205-235 °C |
Pro2 3D printer | Raise 3D | ||
Pyrex 1 L beaker | |||
PYREX 100 mL storage bottles | Corning | 1395-100 | CH3OH/C3H6O reuse |
Pyrex 250 mL beakers | |||
Pyrex 4 L beaker | |||
Quad-view Image Splitter | Photometrics | Model QV2 | |
Refrigerated centrifuge | Eppendorf | EP-5415R | |
RevCount Cell Counters, EVE Cell Counting Slides | VWR | 10027-446 | |
Semrock emission filters: blue (445/45 nm), green (525/45 nm), red (600/37 nm), far-red (685/40 nm) | Semrock | LF405/488/561/635-4X4M-B-000 | |
Serological pipette controller | |||
Serological Pipettes | |||
smite single molecule analysis package | https://github.com/LidkeLab/smite.git | ||
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma Aldrich | S6014 | Hazardous |
Sodium Borohydride (NaBH4) | Millipore Sigma | 452874 | Tyrode's Buffer Component |
Sodium Chloride (NaCl) | Millipore Sigma | S9625 | Activate by successive heat and pH cycling |
Sodium Hydroxide | VWR | BDH3247-1 | |
Sodium Orthovanadate (Na3VO4) | Millipore Sigma | S6508 | Hazardous |
Sulfuric Acid (H2SO4) | Millipore Sigma | 258105 | Hazardous |
TetraSpeck Microspheres | Thermo Fisher Scientific | T7279 | multi-fluorescent beads |
Tris (Trizma) base | Millipore Sigma | T1503 | |
Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | |
Trypsin-EDTA 0.05% | Thermo Fisher Scientific | 25300120 |