Nachweis des Wolbachia-Stammes wAlbB in Aedes albopictus-Zelllinien
Summary
Vier Methoden wurden verwendet, um intrazelluläre Wolbachia nachzuweisen, die sich gegenseitig ergänzten und die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion von Aedes albopictus-abgeleiteten Aa23 und Aa23-T, die von nativer Wolbachia-Infektion mit Antibiotika geheilt wurden, verbesserten.
Abstract
Als mütterlich beherbergter Endosymbiont infiziert Wolbachia große Teile der Insektenpopulationen. Studien haben kürzlich über die erfolgreiche Regulation der RNA-Virusübertragung mit Wolbachia-transfizierten Moskitos berichtet. Zu den wichtigsten Strategien zur Kontrolle von Viren gehören die Manipulation der Wirtsreproduktion durch zytoplasmatische Inkompatibilität und die Hemmung viraler Transkripte durch Immun-Priming und Konkurrenz um vom Wirt abgeleitete Ressourcen. Die zugrunde liegenden Mechanismen der Reaktionen von Wolbachia-transfizierten Moskitos auf eine Virusinfektion sind jedoch kaum verstanden. Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die In-vitro-Identifizierung von Wolbachia-Infektionen auf Nukleinsäure- und Proteinebene in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23-Zellen vor, um das Verständnis der Wechselwirkungen zwischen Wolbachia und seinen Insektenvektoren zu verbessern. Durch die kombinierte Verwendung von Polymerase-Kettenreaktion (PCR), quantitativer PCR, Western Blot und immunologischen Analysemethoden wurde ein morphologisches Standardprotokoll für den Nachweis von Wolbachia-infizierten Zellen beschrieben, das genauer ist als die Verwendung einer einzigen Methode. Dieser Ansatz kann auch auf den Nachweis einer Wolbachia-Infektion in anderen Insektentaxa angewendet werden.
Introduction
Die Asiatische Tigermücke Aedes albopictus (Skuse) (Diptera: Culicidae), die in Asien und anderen Teilen der Welt ein Schlüsselvektor des Dengue-Virus (DENV) ist1, ein natürlicher Wirt von zwei Arten der intrazellulären Bakterien, Wolbachia (w AlbA und wAlbB), die über die Keimbahn und das somatische Gewebe verteilt sind 2,3. Die Aa23-Zelllinie, die aus A. albopictus-Embryonen gewonnen wird, besteht aus mindestens zwei morphologischen Zelltypen, die beide die Infektion4 unterstützen und mit Antibiotika (Aa23-T) von einer nativen Wolbachia-Infektion geheilt werden können. Da Aa23 nur wAlbB behält, ist es ein nützliches Modell für die Untersuchung von Wirt-Endosymbionten-Interaktionen 4,5,6.
Wolbachia wird mütterlich übertragen und infiziert schätzungsweise 65% der Insektenarten 8,9 und 28% der Mückenarten10. Es infiziert eine Vielzahl von Geweben und bildet eine intime symbiotische Beziehung mit dem Wirt, die normalerweise zytoplasmatische Inkompatibilität (CI)11 und Populationsersatz durch Manipulation des Wirtsfortpflanzungssystems12,13 induziert. Diese Wirtsreaktionen wurden in natürlichen Populationen von Drosophila simulans14 und in A. aegypti in einem Laborkäfig und Feldversuch15 beobachtet. Eine wichtige nichtreproduktive Manipulation, die durch Wolbachia ausgelöst wird, ist die induzierte Wirtsresistenz gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern, einschließlich DENV, Chikungunya-Virus (CHIKV) und West-Nil-Virus (WNV) 16,17, die durch ein verbessertes angeborenes Immunsystem des Symbiontenvermittelt werden können 18,19, die Konkurrenz zwischen Wolbachia und Viren um essentielle Wirtsressourcen 20 und die Manipulation von viralen Abwehrwegen des Wirts 21 .
Dieses Protokoll wurde entwickelt, um diese zugrunde liegenden Mechanismen der antiviralen Reaktionen des Wolbachia-induzierten Wirts zu untersuchen. Es verwendet vier Methoden zum Nachweis der intrazellulären Wolbachia-Infektion von Aa23-Zellen. Diese Methoden bieten eine starke theoretische Grundlage für Studien zur intrazellulären Wolbachia-Infektion anderer Wirtsarten. Die erste Methode, die PCR – eine leistungsstarke Technik, die die enzymatische Amplifikation bestimmter DNA-Regionen ohne Verwendung herkömmlicher Klonierungsverfahren ermöglicht – wurde verwendet, um Wolbachia-DNA nachzuweisen und das Vorhandensein / Fehlen einer Wolbachia-Infektion zu bestimmen 22. Die zweite Methode misst die Wolbachia-DNA-Kopierdichte mittels quantitativer PCR (qPCR) für den zuverlässigen Nachweis und die Messung von Produkten, die während jedes PCR-Zyklus erzeugt werden, der direkt proportional zur Menge der Vorlage vor PCR23 ist. Die dritte Methode erkennt das Vorhandensein von intrazellulären Wolbachia-Proteinen unter Verwendung von Western Blot – einem der leistungsfähigsten Werkzeuge zum Nachweis spezifischer Proteine in komplexen Gemischen, indem es die hohe Trennleistung der Elektrophorese, die Spezifität von Antikörpern und die Empfindlichkeit chromogener enzymatischer Reaktionen kombiniert. Die letzte Methode ist ein Immunfluoreszenz-Assay (IFA), der Immunologie, Biochemie und Mikroskopie kombiniert, um das Wolbachia-Oberflächenprotein (wsp) durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion nachzuweisen, um die zelluläre Aufnahme von Wolbachia zu bestätigen und seine zelluläre Lokalisation zu bestimmen.
Dieses Papier beschreibt die vier oben aufgeführten Methoden, um die Existenz von Wolbachia in den Zellen zu überprüfen, mit denen nachgewiesen werden kann, ob die exogene Wolbachia erfolgreich transfiziert und die Wolbachia in der Zelle beseitigt wurde. Nachdem festgestellt wurde, ob Wolbachia in den Zellen vorhanden ist oder nicht, können verschiedene Analysen durchgeführt werden, einschließlich Genomik, Proteomik oder Metabolomik. Dieses Protokoll demonstriert den Nachweis von Wolbachia durch Aa23-Zellen, kann aber auch in anderen Zellen verwendet werden.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der Nachweis einer intrazellulären Wolbachia-Infektion ist essentiell für die Untersuchung von Wolbachia-Wirt-Interaktionen und die Bestätigung einer erfolgreichen Transfektion von Zellen mit neuartigen Stämmen. In diesem Protokoll wurden vier Methoden verwendet, um eine intrazelluläre Wolbachia-Infektion auf Nukleinsäure- und Proteinebene erfolgreich nachzuweisen. Diese vier experimentellen Methoden bestätigten und verbesserten die Nachweisgenauigkeit der Wolbachia-Infektion vo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Dr. Xin-Ru Wang von der University of Minnesota für aufschlussreiche Anregungen und Anleitungen. Diese Arbeit wurde durch ein Stipendium der National Natural Science Foundation of China (No.81760374) unterstützt.
Materials
| Microscope | Zeiss | SteREO Discovery V8 | |
| Petri dish | Fisher Scietific | FB0875713 | |
| Pipette | Pipetman | F167380 | P10 |
| inSituX platform | |||
| Analysis software | In-house developed | ||
| Cerium doped yttrium aluminum garnet | MSE Supplies | Ce:Y3Al5O12, YAG single crystal substrates | |
| Chip holder | In-house developed | ||
| Control software | In-house developed | ||
| Immersion oil | Cargille Laboratories | 16482 | Type A low viscosity 150 cSt |
| inSituX platform | In-house developed | ||
| IR light source | Thorlabs Incorporated | LED1085L | LED with a Glass Lens, 1085 nm, 5 mW, TO-18 |
| Outer ring | In-house developed | ||
| Pump lasers | Thorlabs Incorporated | LD785-SE400 | 785 nm, 400 mW, Ø9 mm, E Pin Code, Laser Diode |
| Raspberry Pi | Raspberry Pi Fundation | ||
| Retaining ring | Thorlabs Incorporated | SM1RR | SM1 retaining ring for Ø1" lens tubes and mounts |
| Seedless quartz crystal | University Wafers, Inc. | U01-W2-L-190514 | 25.4 mm diameter Z-cut 0.05 mm thickness double side polish 8 mm on -X |
| Shim | In-house developed | ||
| X-ray beam stop | In-house developed |
Referências
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