Summary

Evaluación de un biomarcador fiable en un modelo de sepsis de sepsis inducida por punción cecal y ligadura cecal

Published: December 09, 2022
doi:

Summary

Este protocolo presenta los detalles operatorios de la ligadura y punción cecal (CLP) en un modelo de sepsis en ratones. CLP es una de las técnicas más utilizadas para crear un modelo animal de sepsis. Por lo tanto, se requiere un protocolo CLP estandarizado para el logro de resultados de investigación confiables.

Abstract

La sepsis es una enfermedad grave potencialmente mortal y de rápido desarrollo que causa millones de muertes anualmente en todo el mundo. Los investigadores han hecho enormes esfuerzos para dilucidar la fisiopatología de la sepsis utilizando varios modelos animales; el modelo de ratón de sepsis inducida por ligadura y punción cecal (CLP) es ampliamente utilizado en los laboratorios. Los tres aspectos técnicos que afectan la gravedad y replicabilidad del modelo CLP son el porcentaje de ciego ligado, el tamaño de la aguja utilizada para la punción cecal y el volumen de heces comprimidas en la cavidad abdominal. El diagnóstico rápido y específico de sepsis es un factor crucial que afecta el resultado. El estándar de oro para el diagnóstico de sepsis es el cultivo microbiano; Sin embargo, este proceso lleva mucho tiempo y, a veces, es inexacto. La detección de biomarcadores específicos de sepsis es rápida, pero los biomarcadores existentes son insatisfactorios debido a una vida media corta, no especificidad y sensibilidad insuficiente. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de un biomarcador confiable de sepsis en las primeras etapas. Publicaciones anteriores sugieren que el exceso de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE) ocurren en la sepsis. La histona citrulinada H3 (CitH3), como componente NET, está elevada tanto en animales sépticos como en pacientes, y la presencia de CitH3 es un biomarcador diagnóstico fiable de sepsis. El presente estudio tuvo como objetivo describir un modelo estandarizado de ratón de sepsis inducida por CLP y establecer un biomarcador sanguíneo confiable de sepsis. Nuestro trabajo puede contribuir al diagnóstico temprano y preciso de la sepsis en el futuro.

Introduction

La sepsis se define como una disfunción orgánica potencialmente mortal causada por una respuesta desregulada del huésped a la infección1, y el shock séptico es la principal causa de muerte en casos graves de sepsis2. La sepsis y el shock séptico causan millones de muertes en todo el mundo cada año3. La clave para mejorar el resultado de los pacientes con sepsis es el inicio oportuno de tratamientos como los antibióticos4. El método estándar de oro para el diagnóstico de la sepsis es el cultivo microbiano; Sin embargo, el cultivo microbiano consume mucho tiempo y puede conducir a resultados falsos positivos y falsos negativos, lo que limita en gran medida la importancia clínica5. Por lo tanto, es altamente deseable identificar un biomarcador sanguíneo de sepsis. La procalcitonina es reconocida como un biomarcador ideal de sepsis, pero tiene una eficacia diagnóstica limitada porque es incapaz de distinguir la sepsis de las enfermedades estériles6.

La ligadura y punción cecal del ratón (CLP) se usa comúnmente para crear un modelo de sepsis en la investigación científica. La CLP es uno de los modelos de sepsis más utilizados porque imita la peritonitis polimicrobiana, activando respuestas inmunes tanto proinflamatorias como antiinflamatorias7. Es bien aceptado que CLP crea un modelo de sepsis clínicamente más relevante que las técnicas alternativas, como la inyección de endotoxina bacteriana. Por lo tanto, CLP es considerado el modelo clásico de sepsis para su uso en investigación8. Sin embargo, una desventaja importante de CLP es su reproducibilidad, ya que la gravedad del modelo se ve afectada por varios factores, como el porcentaje de ciego ligado, el tamaño de la aguja, el número de punciones y la técnica de laparotomía. Por lo tanto, es necesario estandarizar el modelo de sepsis inducida por CLP. El presente estudio describe los detalles del protocolo del modelo de sepsis inducida por CLP para mostrar el procedimiento estandarizado y aumentar su reproducibilidad.

La respuesta inflamatoria ocurre en la etapa temprana de la sepsis, con neutrófilos liberando cantidades excesivas de oxidantes y proteasas que causan daño a los órganos8. Un factor clave en la fisiopatología de la sepsis es la formación de trampas extracelulares de neutrófilos (TNE), que liberan componentes nucleares y citosólicos como ADN, histonas citrulinadas y proteinasas antimicrobianas9. Estudios recientes sugieren que la generación excesiva de TNE media la patología de la sepsis; mientras tanto, una disminución de los TNE, a través de la inhibición enzimática de peptidil arginina deiminasa (PAD) por productos químicos como YW3-56 o Cl-amidina, ejerce un efecto pro-supervivencia en modelos de ratón de sepsis10,11. La histona citrulinada H3 (CitH3) fue identificada como una proteína específica de sepsis en 201112, y publicaciones posteriores han demostrado que la concentración circulante de CitH3 es un biomarcador diagnóstico fiable de sepsis13,14. La citH3 se considera un biomarcador más sensible y duradero que la procalcitonina, y es más específica para distinguir la sepsis que las citoquinas inflamatorias13.

En este estudio, hemos evaluado un biomarcador diagnóstico fiable de sepsis en un modelo de sepsis de ratón inducido por CLP.

Protocol

Todos los experimentos con animales se realizaron de acuerdo con las directrices aprobadas por el Comité de Revisión de Animales del Hospital Xiangya y la Universidad Central del Sur (No. 202103149). 1. Preparación Seleccione ratones machos C57BL / 6J (peso: 20-25 g; edad: 8-12 semanas) y albergue durante 3 días antes de realizar cualquier procedimiento. Pesa el ratón. Anestesiar al ratón con isoflurano al 1,5% por inhalación y pellizcar lo…

Representative Results

Como se muestra en la Figura 2A, no se detectó CitH3 en el grupo simulado por Western blotting. La concentración sérica de CitH3 aumentó significativamente después de CLP, y este aumento fue bloqueado por la inhibición de la formación de NET a través de la administración de YW3-56, un inhibidor de la EAP10. La figura 2B muestra las concentraciones séricas de CitH3 determinadas por ELISA. A las 24 h después de CLP, la c…

Discussion

CLP introduce patógenos en el abdomen para crear un modelo preclínico de sepsis. Al realizar CLP, es importante utilizar condiciones estériles para eliminar la interferencia de bacterias exógenas y utilizar dosis precisas de anestésicos16. Los tres aspectos técnicos de CLP que afectan la gravedad y replicabilidad del modelo de sepsis son el porcentaje de ciego ligado, el tamaño de la aguja utilizada para la punción cecal y el volumen de heces comprimidas en la cavidad abdominal. La ligadur…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Agradecemos al profesor Wang Wei y al doctor Liu Shuai por ayudar con los experimentos. Este trabajo fue financiado por subvenciones de Young Research Funding del Hospital Xiangya, Central South University (No. 2019Q10), de la Fundación Nacional y Científica de la Provincia de Hunan (No. 2020JJ4902) y de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No. 82202394).

Materials

21G needle
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine  R&D Systems Inc DY999
anti-CitH3 monoclonal antibody laboratory self developed
anti-CitH3 polyclonal antibody Abcam ab5103
anti-rabbit secondary antibody Jackson ImmunoResearch 111-035-003
C57BL/6 mice Xiangya School of Medicine, Central South University
Cl-amidine Sigma Aldrich SML2250
depilatory cream
Dnase I Sigma Aldrich 11284932001
isoflurane Sigma-Aldrich 26675-46-7
ketoprofen Sigma Aldrich PHR1375
silk sutures (4-0 & 6-0)
surgical instruments 
YW3-56 GLPBIO GC48263

Referências

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Citar este artigo
Yaozhen, L., Kemin, W., Xiaoyu, J., Yang, O., Hongying, T., Baihong, P. Evaluation of a Reliable Biomarker in a Cecal Ligation and Puncture-Induced Mouse Model of Sepsis. J. Vis. Exp. (190), e63584, doi:10.3791/63584 (2022).

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