Kometanalysen är ett populärt sätt att upptäcka DNA-skador. Denna studie beskriver ett tillvägagångssätt för att köra glidbanor i representativa varianter av kometanalysen. Detta tillvägagångssätt ökade avsevärt antalet prover samtidigt som analyskörningstiden minskade, antalet glidmanipulationer och risken för skador på geler.
Celler utsätts kontinuerligt för medel som härrör från de inre och yttre miljöerna, vilket kan skada DNA. Denna skada kan orsaka avvikande cellfunktion, och därför kan DNA-skador spela en avgörande roll i utvecklingen av, tänkbart, alla större mänskliga sjukdomar, t.ex. cancer, neurodegenerativ och hjärt-kärlsjukdom och åldrande. Encellig gelelektrofores (dvs. kometanalysen) är en av de vanligaste och känsligaste metoderna för att studera bildandet och reparationen av ett brett spektrum av typer av DNA-skador (t.ex. enkel- och dubbelsträngsbrott, alkali-labila platser, DNA-DNA-tvärbindningar och, i kombination med vissa reparationsenzymer, oxiderade puriner och pyrimidiner), både in vitro och in vivo system. Den låga provgenomströmningen för den konventionella analysen och mödosamma provupparbetning är dock begränsande faktorer för dess bredaste möjliga tillämpning. Med “poängsättningen” av kometer alltmer automatiserad är begränsningen nu möjligheten att bearbeta ett betydande antal kometbilder. Här har en HTP-variant (high-throughput) av kometanalysen (HTP-kometanalys) utvecklats, vilket avsevärt ökar antalet analyserade prover, minskar analysens körtid, antalet enskilda glidmanipulationer, reagenskrav och risk för fysisk skada på gelerna. Dessutom minskar elektroforestankens fotavtryck avsevärt på grund av glidbanornas vertikala orientering och integrerad kylning. Här rapporteras också ett nytt tillvägagångssätt för kylning av kometanalysglas, vilket bekvämt och effektivt underlättar stelningen av kometgelerna. Här har tillämpningen av dessa anordningar på representativa kometanalysmetoder beskrivits. Dessa enkla innovationer stöder i hög grad användningen av kometanalysen och dess tillämpning på studieområden som exponeringsbiologi, ekotoxikologi, biologisk övervakning, toxicitetsscreening / testning, tillsammans med förståelse av patogenes.
Celler utsätts kontinuerligt för medel som härrör från de inre och yttre miljöerna, vilket kan skada DNA 1,2. Denna skada kan orsaka avvikande cellfunktion3, och därför kan DNA-skador spela en avgörande roll i utvecklingen av många stora mänskliga sjukdomar, t.ex. cancer, neurodegenerativ och hjärt-kärlsjukdom och åldrande4. Kometanalysen (även kallad encellig gelelektrofores) är en alltmer populär metod för att detektera och kvantifiera cellulär DNA-skada.
Som enklast upptäcker den alkaliska kometanalysen (ACA) strängbrott (SB; både enkla och dubbla), tillsammans med apuriniska / apyrimidiniska platser och alkali-labila ställen (ALS) som båda blir enkelsträngade brott under alkaliska förhållanden5. Den neutrala pH-kometanalysen kan utvärdera uppriktiga enkel- och dubbelsträngsbrott6. Dessutom kan ACA, i kombination med ett antal DNA-reparationsenzymer, detektera ett betydande antal typer av DNA-skador, t.ex. oxiderade puriner (identifierade genom användning av humant 8-oxoguanin-DNA-glykosylas 1; hOGG17); oxiderade pyrimidiner (med användning av endonukleas III; EndoIII) och cyklobutanpyrimidindimerer (med användning av T4-endonukleas V; T4endoV)8. Kometanalysen kan också användas för att utvärdera DNA-lesioner inducerade av tvärbindningsmedel, såsom cisplatin 9,10,11. Som indikeras av analysens formella namn, dvs. encellsgelelektrofores, är analysen beroende av att cellerna som analyseras är en enda cellsuspension; Oftast är dessa odlade celler men kan isoleras från helblod 12,13, eller helblod i sig kan användas 14,15. Alternativt kan en encellssuspension genereras från fasta vävnader.
Bortsett från några få undantag, framför allt CometChip-rapporterna från Engleward lab 16, har det övergripande kometanalysprotokollet inte förändrats dramatiskt från det som ursprungligen beskrevs av analysens uppfinnare (Östling och Johansson17 och Singh etal.18). Kometanalysen omfattar många steg (figur 1). Många av dessa steg involverar överföring av de tunna, cellinnehållande agarosgelerna, en bild i taget, och utgör därför en risk för skada eller förlust av gelén, vilket äventyrar experimentets framgång. Följaktligen kan kometanalysen vara tidskrävande, särskilt om ett betydande antal bilder körs. Vanligtvis körs högst 40 bilder i en stor (33 cm x 59 cm x 9 cm) elektroforestank, som sitter i en ännu större bricka som innehåller våt is för kylning. Det har nyligen rapporterats att analystiden kan förkortas till 1 dag genom att minska lysstegets varaktighet och inte torka bilderna före färgning19.
De nuvarande författarna har tidigare rapporterat ett nytt tillvägagångssätt för alkalisk kometanalys med hög genomströmning (HTP ACA), där flera (satser av 25) kometanalysmikroskopglas kan manipuleras samtidigt under hela kometanalysprocessen20,21,22. Detta patenterade tillvägagångssätt minimerar risken för skador på eller förlust av de provinnehållande gelerna genom att ta bort behovet av att manipulera mikroskopglasen individuellt och kan appliceras på alla varianter av kometanalysen, som använder mikroskopglas. De glidinnehållande ställen skyddar gelerna under manipulationerna, och följaktligen är provbearbetningen snabbare och effektivare. Bilderna kan också genomgå elektrofores i ställen, som hålls i vertikal, snarare än horisontell, orientering. Denna och integrerade kylning minskar avsevärt elektroforestankens fotavtryck och tar bort behovet av våt is. Sammantaget innebär detta en betydande förbättring jämfört med det konventionella förfarandet. Den utrustning som används illustreras i figur 2. De protokoll som beskrivs här, med hjälp av detta nya tillvägagångssätt, visar den representativa tillämpningen på odlade celler och helblod14 för detektion av alkali-labila platser (ALS), DNA-tvärbindningar (ICL) och substraten för olika DNA-reparationsenzymer.
Denna studie visar mångsidigheten som tillhandahålls av den nuvarande utrustningen, som kan användas för att uppnå hög genomströmning med en mängd representativa, vanliga varianter av kometanalysen (dvs. alkalisk, enzymmodifierad, blod och ICL, och andra varianter kommer också att vara lämpliga). Dessutom medför detta tillvägagångssätt flera fördelar 20,21: (a) analyskörningstiden minskar på grund av manipulering av flera bilder parallellt (hanteringstiden minskar med60%); b) risken för skador på geler och därmed risken för försöket minskar, c) Reagensbehovet minskar (t.ex. elektroforesbehållarens volym är mindre än den konventionella tanken). d) antalet rutschkanor som körs ökas. En tank kan ge en 20% ökning av antalet körda bilder jämfört med en enda konventionell tank; emellertid kan flera elektroforestankar köras eller slavas (dvs. flera tankar som styrs av en enda strömförsörjning), parallellt från samma strömförsörjning, och kräver fortfarande ett bänkavtryck som är mindre än en enda konventionell tank med isbricka; och (e) tankens fotavtryck minskar på grund av vertikal orientering av glidbanor och integrerad kylning (sparar labbutrymme); HTP-tanken består av en högpresterande keramisk kylbas med en glidlåda som kan passa ett fryst kylpaket för att bibehålla optimal bufferttemperatur utan att behöva utföra processen i ett kylrum.
Dessutom rymmer kylplattan som utvecklats av oss 26 kometglas, möjliggör snabb stelning av den låga smältpunkten agaros på kometanalysglasen och underlättar en enkel hämtning av objektglasen efter att agarosgelén har stelnat. Ovanstående innovationer gör kometanalysprocessen enklare och enklare.
Medan andra metoder med hög genomströmning har utvecklats (t.ex. 12-gelkometanalys, CometChip eller 96 minigelformat)25, föredrar många forskare att använda de konventionella mikroskopglasen (som inkluderar de kommersiellt tillgängliga förbelagda bilderna eller andra specialiserade bilder). Det nuvarande tillvägagångssättet kan rymma alla typer av mikroskopglas, vilket gör att experiment med dessa bilder kan skalas upp genom snabbare bildbearbetning och hantering. Som nämnts ovan ger HTP-kometsystemet många fördelar, men det finns en anmärkningsvärd begränsning: det nuvarande tillvägagångssättet ger endast en 20% ökning av antalet prover som körs, jämfört med en konventionell horisontell tank (även om bearbetning av bilder är mycket snabbare). CometChip- och 96 mini-gel-formaten kör ett större antal prover. Hittills vet vi inte om det nuvarande tillvägagångssättet kan rymma CometChip- eller 96 mini-gelformat, även om vi förutspår att det kommer att göra det. Som nämnts ovan kan antalet prover ökas ytterligare genom att slava tankar till en enda strömförsörjning. Som med alla tillvägagångssätt finns det fortfarande en chans att förlora eller skada gelerna medan du laddar prover och analyserar dem under mikroskopet, men detta beror mer på operatörsfel, och chanserna för detta minimeras med det nuvarande tillvägagångssättet.
Användningen av HTP-kometsystemet kan i hög grad hjälpa till att analysera DNA-skador, underlätta användningen av kometanalysen i ett brett spektrum av applikationer, såsom molekylär epidemiologi, manlig reproduktionsvetenskap, genotoxikologiska studier och miljötoxikologi. Detta gäller särskilt för de användare som vill ha alla fördelar med förbättrad genomströmning och användarvänlighet utan att gå bort från de välbekanta, kostnadseffektiva, konventionella mikroskopglasen.
The authors have nothing to disclose.
Det arbete som rapporteras i denna publikation stöddes delvis av National Institute of Environmental Health Sciences vid National Institutes of Health under prisnummer: 1R41ES030274. Innehållet är enbart författarnas ansvar och representerar inte nödvändigtvis den officiella uppfattningen från National Institutes of Health.
22 x 22 mm glass coverslips | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | 631-0124 | |
A2780 | ECACC, Louis, MO, USA |
93112519 | |
Concentrated nitric acid (OptimaTM grade) | Fisher Scientific Fair Lawn, NJ, USA | A467-250 | |
Fluorescence microscope equipped with a camera | Zeiss, Jena, Germany | ||
Fresh human whole blood | Zen Bio Inc | SER-WB10ML | Commercial human whole blood sample |
GraphPad Prism | GraphPad Software, San Diego, California | Data analysis software | |
HTP Comet Assay system | Cleaver Scientific | COMPAC- 50 | |
Human Keratinocyte (HaCaTs) | American Type Culture Collection (ATCC), Manassas, VA, USA | Discontinued | Can be purchased from another company ADDEXBIO TECHNOLOGIES Cat# T0020001 |
Hydrogen peroxide (H2O2) 30% in water |
Fisher Scientific, Hampton, NH, USA | BP2633-500 | |
ICP-MS iCAP RQ ICP-MS system |
Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
IQLAAGGAAQFAQKMBIT | |
Image and Data Analysis software | Perceptive Instrument, Bury St Edmunds, England, UK |
125525 | Free image analysis softwared is available e.g., ImageJ |
Internal Standard Mix | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
CL-ISM1-500 | Bismuch (isotope monitored 209 Bi)-concnetration of 10 µg/mL in 5% HNO3 |
Low melting point Agarose | Invitrogen Waltham, MA, USA |
P4864 | |
Na2EDTA (disodium ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
NaCl (Sodium chloride) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
S7653 | |
NanoDrop One | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
701-058108 | Nanodrop for measuring DNA concentration |
Nanopure Infinity Ultrapure Water System (Barnstead Nanopure) | Thermo Scientific, Waltham, MA, USA |
D11901 | Ultrapure water (16 MΩ cm-1) |
NaOH (sodium Hydroxide) | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
E5134 | |
Normal melting point Agarose | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
16520100 | For pre-coating slides |
OCI-P5X | University of Miami, Miami, FL, USA |
N/A | Live Tumor Culture Core facility provided the cells |
Platinum (Pt) reference standard | SPEX Certiprep, Metuchen, NJ, USA |
PLPT3-2Y | (1000 µg/mL in 10% HCl) containing Bismuch |
Propidium Iodide (1.0 mg/mL in water) |
Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
12-541BP486410ML | |
QIAamp DNA Mini Kit | Qiagen Valencia, CA, USA |
51304 | DNA extraction Kit |
Single-frosted glass microscope slides | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
12-541B | |
SKOV3 | ECACC, Louis, MO, USA |
91091004 | |
Slide box | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
03-448-2 | Light proof, to protect cells from the formation adventitious damage (according to the widely held view) and prevent fading of the fluorescent dye |
Slide Chilling plate | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
CSL-CHILLPLATE | |
Treatment dish | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
STAINDISH4X | |
Tris-base | Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA |
93362 | |
Triton X-100 | Fisher Scientific, Hampton, NH, USA |
BP151-500 | |
Trypsin EDTA (0.5%) | Invitrogen Gibco, Waltham, MA, USA |
15400054 | |
Vertical Slide Carrier | Cleaver Scientific, Rugby, England, UK |
COMPAC-25 |