Fingerprinting von Cardiolipin in Leukozyten mittels Massenspektrometrie zur schnellen Diagnose des Barth-Syndroms

Das Barth-Syndrom (BTHS) ist eine seltene X-chromosomale Erkrankung, die durch früh einsetzende Kardiomyopathie, Skelettmuskelmyopathie, Wachstumsverzögerung, Neutropenie, variable mitochondriale Atmungskettendysfunktion und abnormale mitochondriale Struktur^{gekennzeichnet ist} 1,2,3,4,5. BTHS hat eine Prävalenz von einem Fall pro Million Männer mit derzeit weniger als 250 bekannten Fällen weltweit, obwohl es allgemein anerkannt ist, dass die Krankheit unterdiagnostiziert^{ist 2,6}. BTHS resultiert aus Funktionsverlustmutationen des Tafazzin (TAFAZZIN) -Gens, die auf dem Chromosom Xq28.12^7,8 lokalisiert sind und eine mangelhafte Umgestaltung des mitochondrialen Phospholipids Cardiolipin (CL) verursachen, ein Prozess, der normalerweise zu einer hochsymmetrischen und ungesättigten Acylzusammensetzung führt ^9,10. CL wurde als Signaturlipid der Mitochondrien angesehen, wo es ein wichtiger Bestandteil der inneren Membran ist, der für die oxidative Phosphorylierung (dh den mitochondrialen Energiestoffwechsel), die Bildung von Superkomplexen, den Proteinimport und die mitochondriale Dynamik, Mitophagie und Apoptose unerlässlich ist 11,12,13,14,15,16 . Bei Verlust der Funktion von TAFAZZIN schlägt der CL-Remodeling fehl und spezifische Phospholipidanomalien treten in den Mitochondrien von BTHS-Patienten auf: Der reife CL-Spiegel (CLm) ist erniedrigt, während erhöhte Spiegel von Monolysocardiolipin (MLCL) und veränderter CL-Acylzusammensetzung (dh unreife CL-Spezies, CLi) auftreten. Dies führt zu einem dramatischen Anstieg des MLCL/CL-Verhältnisses^{um 17}.

Die Diagnose von BTHS ist oft schwierig, da die Erkrankung extrem unterschiedliche klinische und biochemische Merkmale aufweist und sich zwischen betroffenen Personen aus derselben Familie und innerhalb eines Patienten im Laufe der Zeit unterscheiden kann ^3,5. Viele BTHS-Jungen zeigen eine sehr hohe Harnausscheidung von 3-Methylglutaconsäure (3-MGCA), aber der Urinspiegel kann bei Patienten im Laufe der Zeit normal oder nur leicht erhöht^{sein 3}. Ein erhöhter 3-MGCA ist jedoch ein Merkmal verschiedener anderer mitochondrialer und nicht-mitochondrialer Erkrankungen, wie 3-Methylglutaconyl-CoA-Hydratase-Mangel (AUH-Defekt), 3-Methylglutaconsäureurie, Dystonie-Taubheit, Enzephalopathie, Leigh-like (MEGDEL) -Syndrom, Costeff-Syndrom und dilatative Kardiomyopathie mit Ataxie (DCMA) -Syndrom^18,19 . Daher machen die schlechte Spezifität von 3-MCGA als Marker für BTHS und die enorme Variabilität der Patienten die biochemische Diagnose mehrdeutig.

Darüber hinaus wurden über 120 verschiedene TAFAZZIN-Mutationen beschrieben, die die Störung⁵ verursachen, und daher kann eine genetische Diagnose kompliziert, langsam und teuer sein. Darüber hinaus kann die molekulare Analyse des TAFAZZIN-Gens zu falsch-negativen Ergebnissen führen, wenn Mutationen in nicht-kodierenden oder regulierenden Sequenzen^{vorliegen 3}. BTHS kann durch Bestimmung der relativen Mengen und Verteilung von (monolyso-)CL-Arten eindeutig getestet und durch TAFAZZIN-Gensequenzierung bestätigt werden oder umgekehrt.

Ein praktischer Test für die Diagnose ist die Messung des MLCL/CL-Verhältnisses durch High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) und Electro Spray Ionization / Mass Spectrotry (ESI/MS) Analyse im Blutfleck^20,21. Die Messung des CL-Spiegels allein ist für die Diagnose nicht ausreichend, da einige Patienten nahezu normale CL-Spiegel aufweisen, aber das MLCL/CL-Verhältnis verändert haben. Daher hat die Messung des MLCL/CL-Verhältnisses eine 100%ige Sensitivität und Spezifität für die BTHS-Diagnose²¹. Eine weitere validierte Methode, die auf HPLC- und ESI/MS-Analysen basiert, wurde auf Leukozyten²² eingerichtet, aber die komplexen chromatographischen Techniken zur Trennung von zuvor extrahierten Lipiden und die Kosten der Instrumente beschränken diese Analyse auf einige wenige klinische Laboratorien. All diese Faktoren, zusammen mit dem Fehlen eines einfachen diagnostischen Tests, haben zur Unterdiagnose der Erkrankung beigetragen.

MALDI-TOF/MS ist ein weiteres valides Werkzeug in der Lipidanalytik^23,24. Diese Analysetechnik kann verwendet werden, um direkt Lipidprofile verschiedener biologischer Proben zu erhalten, wodurch die Extraktions- und Trennschritte 25,26,27,28,29, einschließlich in Gewebeabschnitten für MS Imaging-Anwendungen 30^, übersprungen ^werden. Angesichts dieses Vorteils wurde eine einfache und schnelle Methode zur Diagnose von BTHS durch Profiling von mitochondrialer CL in intakten Leukozyten mit MALDI-TOF/MS entwickelt²⁸. Die Leukozytenisolierung aus nur 1 ml Vollblut durch Erythrozytensedimentation und Lyse ist unkompliziert und erfordert keine spezielle Ausrüstung oder Reagenzien. Darüber hinaus wurde ein schnelles Lipid-“Mini-Extraktions”-Protokoll beschrieben, das auf winzige Mengen von Leukozyten anwendbar ist, um die erfolgreiche Aufnahme von Spektren mit saubereren MS-Signalen mit einem höheren Signal-Rausch-Verhältnis (S/N) als bei intakten Leukozyten²⁸ zu rechtfertigen. Dieser weitere Schritt nimmt wenig Zeit in Anspruch und ermöglicht es, Analysen auch dann reproduzierbar zu machen, wenn sie an MS-Instrumenten mit geringer Empfindlichkeit durchgeführt werden. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die hier beschriebene analytische Methode eine minimale Probenvorbereitung erfordert, da eine zeit- und arbeitsintensive chromatographische Lipidtrennung übersprungen werden kann, wodurch der Test beschleunigt wird.