성장 인자 매개 인테그린 역학 및 접착력을 정량화하기 위한 장력 게이지 테더 프로브

1. TGT 올리고뉴클레오티드 제제 참고: 올리고뉴클레오티드 프로브 합성의 세부사항은 여기에 요약되어 있다. 일부 수정 및 정제 단계는 사용자 정의 합성을 위해 아웃소싱 될 수 있습니다. Zhang et al.22 에 의해 기재된 아지드-NHS 링커와 사이클로[Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys(PEG-PEG)] 펩티드의 1차 아민을 10 μL 디메틸포름아미드의 최종 부피에서 1:1.5 비(100:150 nmoles)로 혼합함으로써 활성화시킨다. 유기 염기 트리에틸아민 0.1μL를 첨가하고 4°C에서 12시간 동안 인큐베이션한다. 생성물을 0.5%/min의 구배로 설정된 1mL/min의 유속 및 10% 용매 B의 초기 조건으로 0.1 M TEAA (용매 A) 및 100% 아세토니트릴 (용매 B)을 사용하여 역상 HPLC에 의해 생성물을 정제한다. 용출된 피크(203nm에서의 흡광도)를 결합하고 MALDI-TOF 질량분석기로 검증한다. 제품은 cRGDfK-azide입니다. TGT 상부 가닥을 생성하려면, cRGDfK-아지드 및 알킨-21-BHQ2 올리고뉴클레오티드(TGT 상부 가닥: 5Hexynyl/GTGAAATACCGACAGATGGG/3BHQ_2)를 1x 인산완충식염수(PBS)의 100μL에 5mM 소듐 아스코르베이트 및 0.1μM 미리 형성된 Cu-THPTA와 함께 2:1 비율(͂200 μM: 100 μM)로 결합한다. 반응이 실온 (RT)에서 최소 4 h 동안 또는 4°C에서 하룻밤 동안 진행되도록 허용한다. 혼합물을 P2 탈염 겔을 통해 처리하여 과량의 염료, 부산물, 유기 용매 및 미반응 시약을 제거한다. 650 μL의 미리 수화된 P2 겔로 원심분리 컬럼을 1분 동안 18,000 x g 에서 아래로 방사하여 제조하였다. 유동 관통 액체를 버리고 반응 혼합물을 첨가한다. 1분 동안 18,000 x g 에서 다시 회전하고 유동을 수집합니다. 반응 혼합물을 초순수로 300 μL의 최종 부피로 가져온다.참고 : P2 젤을 6 시간 동안 물로 미리 수화하십시오. 탈염된 반응 혼합물을 역상 HPLC에 의해 정제한다. 이 정제에 사용되는 유기 용매는H2O(용매 A) 및 100% MeCN (용매 B, 또는 이동상) 중 0.1 M TEAA를 포함한다. 혼합물을 주입하기 전에, 컬럼을 10% 용매 B의 초기 조건과 1%/분의 구배로 평형화시킨다. 유속을 1 mL/분으로 조정하십시오. 반응 혼합물을 500 μL 주입 바늘로 HPLC 루프에 주입한다. DNA에 대해 260 nm에서의 피크 흡수를 시각화하고 BHQ2 소광기에 대해 560 nm에서 피크 흡수를 시각화하여 생성물을 수집한다. 용출된 생성물을 진공 원심 농축기에서 하룻밤 동안 건조시킨다. Ma et에 기재된 바와 같이 TGT 바닥 가닥을 Cy3B-NHS 에스테르에 결합시키기 위해 친핵성 치환을 사용한다. 알25. 100 μM의 56 pN TGT 바닥 가닥 (5Biosg/TTTTTT/iUniAmM/CGCATCTGTGCGGTATTTCACTTT)을 10 μL의 DMSO에 미리 용해된 50 μg의 Cy3B-NHS 에스테르와 혼합한다. 이 혼합물의 pH를 0.1 M 중탄산나트륨으로 9로 조정하고 1x PBS로 최종 부피를 100 μL로 가져온다. 반응 혼합물을 RT에서 밤새 인큐베이션한다. P2 겔 여과 및 역상 HPLC를 사용하여 혼합물을 순차적으로 정제하여 미반응 시약, 염 및 유기 용매를 분리한다(단계 1.4 및 1.5에 기재됨). 정제된 올리고뉴클레오티드-염료 접합체의 농도를 분광광도계를 사용하여 260 nm에서 이들의 흡광도를 기록함으로써 추정한다. 정제된 생성물을 MALDI-TOF 질량 분광법으로 특성화한다. 과량의 3-하이드록시피콜린산을 TA50 용매(50:50 v/v 아세토니트릴 및ddH2O에 0.1% TFA)에 녹여 신선한 MALDI 매트릭스를 제조하였다. 표지된 생성물에 대한 추정 및 측정된 분자량은 다음과 같다: cRGDfK-1-BHQ2 – 8157.9 (계산됨), 8160.1 (발견됨); Cy3B 표지된 56 pN TGT – 10272.7 (계산됨), 10295.8 (발견됨). 상단과 하단 가닥을 30-50 μM 사이의 농도로 뉴클레아제가 없는 물에 따로 녹입니다. 스톡 오염을 방지하려면 DNase가 없는 피펫 팁을 사용하십시오. 단기 적용의 경우 4°C, 장기 적용의 경우 -20°C에서 보관하십시오. 올리고뉴클레오티드의 안정성은 반복된 동결-해동 사이클에 의해 영향을 받지 않는다. 2. 표면 준비 1일차: 25mm 유리 커버슬립(최대 8개)을 폴리테트라플루오로에틸렌 랙에 넣습니다. 랙을 200 프루프 에탄올 40 mL를 함유하는 50 mL 보로실리케이트 비이커에 넣는다. 비커를 파라핀 필름으로 덮어 물이 들어가지 않도록 하고 RT에서 10-15분 동안 35kHz의 작동 주파수에서 초음파 처리합니다(그림 1A). 50 mL 비이커를 파이렉스 비이커에 황산과 과산화수소를 3:1 비율로 혼합하여 갓 제조한 피라냐 용액 40 mL로 채운다. 유리 피펫으로 저어주세요. 커버슬립 랙을 비커로 옮기고 흄 후드의 RT에서 30분 동안 인큐베이션하여 커버슬립 표면을 에칭합니다(그림 1B).참고 : 실험실 코트, 장갑 및 고글을 포함한 전체 PPE를 착용하고 화학 흄 후드에서 작업하십시오. 용액의 과열을 방지하기 위해 산에 과산화수소를 천천히 첨가하십시오. 에칭 후 핀셋을 사용하여 커버슬립 랙을 초순수가 있는 비이커로 옮깁니다. 이 단계를 15초 간격으로 여섯 번 반복하여 산을 완전히 중화시킨다(그림 1C).참고 : Piranha 용액을 산성 폐기물 용기에 버리기 전에 화학 흄 후드에 밤새 두십시오. 커버슬립을 육안으로 검사하여 유리 표면에 패턴이나 먼지 입자가 없어 표면이 깨끗하게 보이는지 확인합니다. 패턴이나 먼지가 감지되면 2.1-2.4단계를 반복합니다.참고: 처리된 커버슬립을 물에 담그고 수직으로 제거하여 표면 친수성을 테스트합니다. 처리 된 커버 슬립의 물은 패치를 형성하는 처리되지 않은 커버 슬립에 비해 영의 고리를 형성하기 위해 균일 한 시트로 물러납니다. 커버슬립 랙을 200 프루프 에탄올로 비이커로 옮기고 15초 동안 두 번 세척하여 표면을 유기 용매와 평형화시킵니다. 커버슬립 랙을 RT에서 1시간 동안 3% APTES가 있는 200 프루프 에탄올 용액으로 옮겨 커버슬립을 실란화합니다(그림 1D). 비커를 파라핀 필름으로 덮으십시오.참고: APTES 증착 파라미터는 표면 세정 방법, 용매 수분 함량, APTES 농도, 배양 시간 및 어닐링 온도에 따라 달라집니다. 랙을 200 프루프 에탄올 용액으로 깨끗한 비이커에 담그십시오. 이 세척을 각각 15초에 대해 세 번 반복하십시오(그림 1E). 커버슬립을 낮은 출구 압력의 질소(N2) 가스를 사용하여 건조시킵니다. 커버 슬립을 10cm 폴리스티렌 접시에 넣고 파라핀 필름 조각을 평평하게 놓습니다. 커버슬립이 건조하고 분리되어 있는지 확인합니다(그림 1F). DMSO 중의 2 mg/mL NHS-비오틴 용액 100 μL를 파라핀 필름 위에 놓인 네 개의 커버슬립에 첨가한다. 다른 4개의 커버슬립을 위에 놓고 (두 개의 커버슬립이 그 사이에 기능화 용액과 함께 서로 향하도록 향함) 4°C에서 하룻밤 동안 접시를 인큐베이션한다(그림 1G).참고 : 4 °C에서 NHS 시약은보다 안정적이어서 균일 한 표면 기능화를 용이하게합니다. 또한 샌드위치는 시약을 보존합니다. 샌드위치에 과도한 용액을 넣으면 샌드위치가 새어 나와 커버 슬립이 미끄러 질 수 있으므로 피하십시오. 2일차: 접시를 4°C에서 분리하고 샌드위치된 커버슬립을 분리합니다. 그림 2A와 같이 코팅된 표면이 서로 마주보도록 랙의 슬립 방향을 조정합니다. 200 프루프 에탄올 용액으로 각각 15 초 동안 세 번 씻으십시오. N2 가스로 말리고 그 안에 파라핀 필름이있는 새 접시에 넣으십시오.참고: 표시된 대로 커버슬립의 방향을 지정하면 기능화된 서피스를 식별하는 데 도움이 됩니다. 커버슬립을 1 mL의 1x PBS로 세 번 세척하여 이들을 다시 수성상으로 평형화시킨다. 800 μL의 0.1% 소 혈청 알부민(BSA)을 1x PBS(w/v)에 첨가하고, 30분 동안 RT에서 인큐베이션하여 표면을 패시베이트하고 후속 기능화 시약의 비특이적 결합을 차단한다(그림 2B). 인큐베이션 후, 커버슬립을 1 mL의 1x PBS로 세 번 세척하였다. 1μg/mL의 스트렙타비딘 800μL를 RT의 1x PBS에 45-60분 동안 첨가하여 커버슬립을 작동화합니다(그림 2C).참고: 패시베이션 효율을 확인하기 위해 스트렙타비딘 없이 커버슬립 하나를 보관하십시오(선택 사항). Add10 nM 비오티닐화 분자 및 실험 조건을 이용한 이미지. 이 표면 강도는 카메라의 어두운 노이즈에 근접해야 합니다. 단계 2.11과 동시에, 열순환기를 사용하여 PCR 튜브에서 1 M NaCl의 100 μL 중 50 nM의 최종 농도로 TGT 프로브 (상부: 1:1 몰비에서 하단 가닥)를 조립한다. 가닥을 95°C에서 5분 동안 해리시키고, 온도를 25°C로 감소시키고 25분 동안 유지함으로써 점진적으로 어닐링한다(도 2D). TGT 프로브가 빛에 장시간 노출되지 않도록 하십시오. 스트렙타비딘 인큐베이션 후, 1x PBS를 사용하여 커버슬립을 세 번 세척한다. 미리 조립된 TGT 프로브 100μL를 4개의 커버슬립에 추가하고 기능화된 면이 프로브를 향하도록 나머지 4개의 커버슬립을 사용하여 샌드위치를 만듭니다(여덟 개의 표면에는 4개의 하이브리드 TGT 프로브 튜브가 필요함). 알루미늄 호일로 덮고 RT에서 1시간 동안 인큐베이션하여 프로브가 표면에 결합할 수 있도록 합니다(그림 2E). 인큐베이션 후, 샌드위치를 분리하고 커버슬립을 1x PBS로 세 번 세척한다. 이제 TGT 표면을 이미징할 준비가 되었습니다. 커버슬립을 미리 세척된 이미징 챔버에 조심스럽게 조립하고 1x PBS를 첨가하여 표면이 수화되도록 합니다(그림 2F).참고: 챔버를 과도하게 조이면 표면이 깨집니다. 표면의 건조를 방지하십시오. 3. 세포 준비 및 염색 Cos-7 역학, 부착 및 세포 확산에 대한 표피 성장 인자 (EGF) 자극의 효과를 조사하기 위해, 2 분 동안 0.05 % 트립신-EDTA로 Cos-7 세포를 트립신화한다. HBSS로 세척하고 5분 동안 800 x g 에서 원심분리하여 트립신을 중화시킨다. 중화 단계를 한 번 더 반복하십시오. 두개골 세포는 50 ng/mL EGF 또는 EGF가 없는 DMEM으로 보충된 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)에서 조립된 TGT 표면 상의 4 x 104 세포의 밀도로 플레이트 세포. 세포를 세포 배양 인큐베이터에서 5%CO2 로 37°C에서 60분 동안 확산시키십시오 (도 3A).참고: 세포는 성장 인자로부터의 자극을 피하기 위해 혈청 없이 DMEM에서 배양된다. EGF는 10 mM 아세트산에 희석되어 1 mg / mL의 스톡을 만듭니다. 이미징 실험을 위해 DMEM에서 50ng/mL로 사용됩니다. 인큐베이션 후, 세포를 1x PBS로 3회 세척하고 RT에서 12분 동안 2 mL의 4% 파라포름알데히드로 고정시켰다(도 3B).참고: 모든 인큐베이션 단계는 용액의 균일한 확산을 위해 ~35rpm의 회전식 쉐이커에서 수행됩니다. TGT 표면이 이미징 준비가 될 때까지 덮음으로써 빛으로부터 보호합니다. 고정제를 흡인하고 커버슬립을 RT에서 5분 간격으로 1x PBS로 5회 세척한다. 임의로, 커버슬립을 37°C에서 30분 동안 1x PBS 중의 50 mMNH4Cl로 인큐베이션하여 파라포름알데히드-관련 자가형광을 켄칭하고, 5분 간격으로 1x PBS로 3회 세척한다(도 3B). 완충액 A(1x PBS, 5% 정상 말 혈청, 5% 정상 염소 혈청, 1% BSA, 0.025% 트리톤 X-100)를 첨가하고, 세포를 차단하고 투과시키기 위해 37°C에서 30분 동안 인큐베이션한다. 5분 간격으로 1x PBS로 3회 세척한다(도 3B). 커버 슬립이있는 이미징 챔버를 습도 용기에 넣으십시오. 1차 항-팍실린 항체(초점 부착 마커)를 블로킹 완충액(1x PBS, 5% 정상 말 혈청, 5% 정상 염소 혈청, 1% BSA, 0.005% 트리톤 x-100)에 1:250으로 희석한다. 커버슬립 당 200 μL의 일차 항체 용액과 함께 37°C에서 2시간 동안 인큐베이션한다(도 3B).참고: 표면이 마르지 않도록 하십시오. 커버슬립을 5분 간격으로 1x PBS로 5회 세척하고 습도 용기로 되돌립니다. 표지 세포는 염료 접합된 염소 항-토끼 이차 항체의 혼합물과 동시에 1:800에서 희석하고, 염료 접합된 팔로이드인(액틴)을 커버슬립당 블로킹 완충액 200 μL에서 1:400 희석하였다. 37°C에서 60분 동안 인큐베이션한다(도 3B). 표면을 5분 간격으로 1x PBS로 5회 세척하고 이미징이 준비될 때까지 4°C에서 보관한다(도 3B).참고: 신호 열화를 방지하기 위해 표면 준비 후 3일 이내에 이미지 샘플. 4. 이미지 획득 488, 561 및 647 TIRF 여기, RICM 여기, 완벽한 초점 시스템 및 디지털 카메라가 있는 거꾸로 된 현미경에 높은 수치 조리개(1.49)가 있는 오일 침지 60x 목표를 사용하십시오. 목표에 오일을 넣고 샘플 챔버의 커버 슬립 바닥을 청소하고 샘플을 무대에 놓습니다. 세포에 집중하고 완벽한 초점을 맞춥니다. 현미경을 부형광 여기와 함께 RICM 이미징 모드에 넣고 방출 필터가 제거된 GFP 필터 큐브를 넣는다. 에피 조명 조리개 다이어프램을 닫고 가운데에 배치하여 RICM을 정렬합니다. 현미경을 레이저 여기 및 쿼드 패스 TIRF 필터 큐브로 TIRF 모드로 전환합니다. 488nm 레이저를 실내의 천장에 있는 작은 지점에 초점을 맞추고 라이브 모드에서 카메라의 형광을 모니터링하면서 임계 각도를 지나갈 때까지 입사각을 높입니다. 임계 각도를 초과할 때 배경 형광의 급격한 감소와 단일 초점 평면을 관찰하십시오.참고: TIRF는 샘플 커버슬립 인터페이스에 가장 가까운 얇은 영역(~100nm)을 여기시켜 개방된 TGT 프로브와 초점 접착을 강조하면서 세포 내에서 초점이 맞지 않는 형광을 제거합니다. TIRF가 이용가능하지 않은 경우, 에피-형광이 사용될 수 있고; 그러나 신호 대 잡음비는 더 낮습니다. RICM을 사용하여 카메라의 “라이브” 모드를 사용하여 이미징할 세포를 식별합니다. 액틴 (640 nm ex), 인테그린 텐션 (561 nm ex), 및 팍실린 (488 nm ex)의 RICM 이미지 및 TIRF 이미지를 획득한다. 200ms의 노출 시간을 사용하여 순차적으로 이미지를 가져옵니다.참고: 노출 시간은 목표, 레이저 출력, 방출 필터 및 카메라 감도를 포함한 여러 요인에 따라 달라집니다. 신호는 배경보다 2배 이상 커야 합니다. 배경은 약 1000 AU이므로 신호는 적어도 2000-3000 AU이어야합니다. 적어도 30 개의 세포에 대해 4.4-4.5를 반복하십시오. 커버슬립, 포커스를 변경하고 4.4-4.5를 반복합니다. 5. 데이터 분석 참고: 피지 소프트웨어를 사용하여 정량적 이미지 분석을 수행하고 통계 소프트웨어를 사용하여 분석하십시오. 한 셀에 대한 이미지 세트를 엽니다. ImageJ 자유형 선택 도구를 사용하여 RICM 이미지에서 셀의 경계를 추적하여 셀 영역의 마스크(RICM 마스크)를 생성합니다. ROI 관리자(ROI 관리자를 > 도구 분석)에 관심 영역(ROI)> 저장합니다(그림 4A1,2). 인테그린 장력 이미지에서 셀 외부의 대표 영역을 선택하고 최소 200 x 200픽셀의 ROI를 그립니다. ROI에서 다른 세포 또는 형광 파편을 제외하십시오. 측정 도구(분석 > 측정)를 사용하여 ROI의 배경 형광을 측정합니다(그림 4A3). 장력 이미지에서 단계 5.2에서 얻은 평균 배경 형광을 뺍니다(공정 > 수학 > 뺄셈)(도 4A4). 5.2단계에서 설정된 RICM 마스크를 사용하여 셀 풋프린트 내의 장력 신호를 정의합니다(ROI 관리자 > 마스크 적용 선택 > 외부 편집 > 지우기)>(그림 4A5). Huang의 자동 임계값 조정 방법(이미지 > 임계값 조정)을 사용하여 장력 이미지> 임계값 마스크를 만듭니다(그림 4A6). 임계값 마스크가 생성된 인테그린 장력의 영역을 가장 잘 나타내는지 확인하십시오. 일반적으로 임계 값을 평균 배경 형광의 2x로 설정하십시오. 임계값 장력 마스크를 선택합니다(선택 > 편집 > 만들기)(그림 4A7). 단계 5.4에서 생성된 텐션 이미지 상으로 선택된 마스크를 전송하고 개방 프로브의 통합 강도를 측정한다(ROI 매니저 > RawIntDen을 > 분석> 측정(Tension Mask)을 선택(Tension Mask)> 선택한다(도 4C). RICM 마스크에서 셀 형태 특성 영역, 원형도 및 종횡비를 측정합니다(ROI 관리자 > 선택 (RICM 마스크) > 마스크 적용 > 분석 > 측정)(그림 4B). 장력 마스크 이미지를 선택하고 RICM 마스크(ROI 관리자, > Select(RICM Mask) > 분석 > 측정>%Area)을 적용하여 파열 프로브를 사용한 셀 발자국의 백분율로 정의되는 기계적 파열 밀도를 측정합니다(그림 4C). 추가 분석 및 시각화를 위한 측정값을 통계 소프트웨어로 내보냅니다. 모든 셀에 대해 5.1-5.11을 반복합니다.