세포 배양 기술은 건강 및 질병 분야의 다양한 세포 신경 생리학 분야에서 수많은 발전을 가져 왔습니다. 특히, 실험실 동물의 신경 조직에서 갓 분리 된 1 차 세포 배양을 통해 실험자는 다양한 생화학 적 배지 및 생리 학적 설정에서 다양한 세포의 행동을 면밀히 연구 할 수 있습니다. Ca²⁺ 민감성 염료와 같은 다양한 형광 생리학적 지표를 타임랩스 비디오 현미경과 함께 사용하면 실시간으로 세포 생물물리학 및 생화학적 과정에 대한 더 나은 통찰력을 얻을 수 있습니다.

ALS는 상부 및 하부 운동 뉴런에 영향을 미치는 치명적인 신경 퇴행성 질환입니다¹. 이 질병은 가족 유형의 복잡한 발병 기전을 가지고 있지만 대부분 산발적 인 형태 (사례의 90 %)^2. 비세포 자율 메커니즘이 ALS 병태생리학에 기여한다는 것은 잘 알려져 있으며, 이는 주로 신경^{교 세포의 필수적인} 역할 때문입니다3. ALS는 또한 염증의 체액 성 및 세포 성 요인의 침범과 함께 신경 염증성 질환으로 잘 특성화됩니다.

면역 글로불린 G는 ALS 및 기타 신경 퇴행성 질환에서 분자 마커로 널리 사용됩니다. 이 마커의 혈청 수준을 연구하면 질병 ^4,5,6에서 신경 염증의 존재와 단계를 나타낼 수 있지만 뇌척수액에 존재하면 혈액 뇌 장벽⁷의 위반을 나타낼 수 있습니다. IgGs는 또한 ALS 환자⁷의 척수 운동 뉴런에서 침착 된 것으로 확인되었습니다. 그럼에도 불구하고,이 접근법은 IgGs 수준과 질병의 단계 및 특성의 상관 관계에서 약간의 불일치를 보여 주었다⁶.

ALS 환자의 혈청에서 분리 된 IgG (ALS IgG)는 나이브 성상 세포⁸에서 칼슘 반응을 유도하고 뉴런에서 글루타메이트 방출을 유도 할 수 있으며, 이는 ALS 병리학⁹의 특징 인 흥분 독성 효과를 가리킨다. 그러나, hSOD1^G93A ALS 래트 모델 (인간 SOD1 돌연변이 10의 다중 카피 함유)에 대한 연구는 배양된 신경교세포 11, 조직 12,13,14^, 또는 살아있는 동물¹³에서 산화 스트레스의 다수의 마커를 보여주었다. ALS 래트 모델로부터 배양된 성상교세포가 비-형질전환 동료로부터의 성상아교세포보다 과산화물에 의해 유도된 산화 스트레스에 더 취약하다는 것은 주목할 만^하다1.

배양 물의 소교 세포는 덜 명백한 방식으로 ALS IgG의 영향을받습니다. 즉, BV-2 소교세포 세포주는 단지 4/11 ALS IgG 환자 샘플¹⁵의 적용에 반응하여 산화 스트레스의 형광 마커로부터의 신호의 상승을 나타냈다. 미세아교세포는 많은 신경염증성 병리에 참여하여 ALS^16,17의 비세포 자율 메커니즘에서 산화 스트레스와 후기 진행 단계를 추가하는 것으로 잘 알려져 있습니다. 그럼에도 불구하고, ALS IgGs를 사용한 데이터는 이들 세포가 ALS 염증의 이러한 체액성 인자에 대해 성상세포만큼 반응적이지 않을 수 있음을 나타내었다. ALS 쥐 모델의 1 차 성상 세포에 대한 여러 연구가 새끼뿐만 아니라 증상이있는 동물, 뇌 또는 척수^18,19,20,21에서 수행되었습니다. 이것은 소교 세포 1 차 배양에도 해당되지만, 성상 세포보다 적고 대부분 배아 단계^22,23,24의 뇌 영역에서 발생합니다.

우리는 주로 흥분 독성의 생리적 마커로서이 이온의 세포 내 과도 현상을 따르는 수단으로 배양 된 세포에 대한^Ca2+의 타임 랩스 비디오 이미징을 사용합니다. 따라서 이러한 과도 현상 (진폭, 과도 상태에서의 영역, 상승 시간, 주파수)의 생물 물리학 적 특성화를 통해 연구원은 신경 퇴행의 다양한 세포 모델에서 실험적 진단 매개 변수를 얻을 수 있습니다. 따라서이 기술은 질병 바이오 마커로서 IgGs의 정량적 생리 학적 평가의 이점을 제공합니다. ALS의 유도에서 IgGs 및^Ca2+의 역할에 관한 많은 문헌이 있다. 이들 연구의 대부분은 환자 IgG를 실험 동물^{25,26,27,28,29}에 주입하여 ALS를 유도함으로써 수행되었으며^, 이어서 세포 내^Ca2+ 상승 및 IgG 침착을 나타내었다. 일련의 연구는 시험관 내 운동 시냅스에 대한 ALS IgG의 효과를 조사했습니다. ^30,31,32. 위의 맥락에서 여기에 제시된 기술은 ALS의 비 세포 자율 메커니즘에서 중요한 역할을하는 신경교 세포에 초점을 맞추고 신경 염증의 체액 성 요인으로서 IgG에 대한 잠재적 인 흥분 독성 반응을 정량화합니다. 이 접근법은 다른 세포 배양 시스템 및 일반적인 염증의 세포 모델에서 전체 혈청, CSF 또는 사이토 카인과 같은 다른 체액 성 인자를 테스트하는 데 더 광범위하게 적용될 수 있습니다.

이 논문은 Sprague Dawley 쥐의 피질에서 신경교 세포, 성상 세포 및 미세 아교 세포의 1 차 배양을 준비하는 방법과 이러한 세포를 추가로 사용하여 환자 혈청 유래 IgG로 ALS 병태 생리학을 연구하는 방법을 설명합니다. 프로토콜은 배양된 세포의 염료 로딩(그림 1) 및 타임랩스 비디오 이미징 실험에서 Ca²⁺ 변화의 기록에 대해 자세히 설명되어 있습니다. 비디오 녹화의 예는 신경교 세포가 ATP와 비교하여 ALS IgG에 어떻게 반응하는지 보여줄 것이며, 후자는 퓨린성 막 수용체를 활성화합니다. hSOD1^G93A ALS 래트 뇌로부터 분리된 성상세포가 비-형질전환 대조군과 비교하여 ALS IgG에 대해 더 뚜렷한^{Ca 2} + 반응과 어떻게 반응하는지, 그리고 이 과정을^Ca2+ 저장 작업의 차이와 연관시키는 방법에 대한 예가 처음으로 도시되었다. 또한 ALS IgG로 심각하게 도전받는 소교 세포에서 칼슘 이미징의 예가 나와 있으며 세포 내 칼슘의 반응은 미미합니다.