Zellkulturtechniken haben zu zahlreichen Fortschritten in verschiedenen Bereichen der zellulären Neurophysiologie in Gesundheit und Krankheit geführt. Insbesondere primäre Zellkulturen, frisch isoliert aus dem neuronalen Gewebe eines Labortieres, ermöglichen es dem Experimentator, das Verhalten verschiedener Zellen in verschiedenen biochemischen Medien und physiologischen Setups genau zu untersuchen. Die Verwendung verschiedener fluoreszierender physiologischer Indikatoren wie der Ca²⁺-sensitiven Farbstoffe in Kombination mit der Zeitraffer-Videomikroskopie ermöglicht einen besseren Einblick in die zellulären biophysikalischen und biochemischen Prozesse in Echtzeit.

ALS ist eine verheerende neurodegenerative Erkrankung, die obere und untere Motoneuronen betrifft¹. Die Krankheit hat eine komplexe Pathogenese des familiären Typs, aber meist der sporadischen Form (90% der Fälle)². Es ist bekannt, dass nicht-zellautonome Mechanismen zur ALS-Pathophysiologie beitragen, vor allem aufgrund der essentiellen Rolle von Gliazellen³. ALS ist auch gut als neuroinflammatorische Erkrankung mit Beteiligung von humoralen und zellulären Faktoren der Entzündung charakterisiert.

Immunglobulin G wird häufig als molekularer Marker bei ALS und anderen neurodegenerativen Erkrankungen verwendet. Die Untersuchung des Serumspiegels dieses Markers kann auf das Vorhandensein und Stadium der Neuroinflammation bei der Krankheit ^4,5,6 hinweisen^, während seine Anwesenheit in der Zerebrospinalflüssigkeit auf eine Verletzung der Blut-Hirn-Schranke 7 hinweisen kann. IgGs wurden auch als Ablagerungen in den Rückenmarks-Motoneuronen von ALS-Patienten identifiziert⁷. Dennoch hat dieser Ansatz einige Inkonsistenzen in der Korrelation des IgG-Spiegels mit dem Stadium und den Merkmalen der Krankheit gezeigt⁶.

Aus den Seren von ALS-Patienten isoliertes IgG (ALS-IgG) kann eine Kalziumreaktion in naiven Astrozyten⁸ und eine Glutamatfreisetzung in Neuronen induzieren, was auf eine exzitotoxische Wirkung hinweist – ein Kennzeichen der ALS-Pathologie⁹. Studien am HSOD1^G93A ALS-Rattenmodell (das mehrere Kopien der menschlichen SOD1-Mutation¹⁰ enthielt) zeigten jedoch eine Reihe von Markern für oxidativen Stress in kultivierten Neurogliazellen¹¹, Geweben 12,13,14 oder lebenden Tieren ¹³. Es ist bemerkenswert, dass die aus dem ALS-Rattenmodell gezüchteten Astrozyten anfälliger für oxidativen Stress waren, der durch Peroxid induziert wurde, als die Astroglia aus nicht-transgenen Wurfgeschwistern¹¹.

Mikrogliazellen in Kultur sind weniger offensichtlich von ALS-IgG betroffen. Eine BV-2-Mikrogliazelllinie zeigte nämlich einen Anstieg des Signals von fluoreszierenden Markern für oxidativen Stress als Reaktion auf die Anwendung von nur 4/11 ALS-IgG-Patientenproben¹⁵. Es ist bekannt, dass Mikroglia an vielen neuroinflammatorischen Pathologien beteiligt sind, was zu oxidativem Stress und der späten Progressionsphase im nicht-zellautonomen Mechanismus von ALS^16,17 beiträgt. Dennoch zeigten die Daten mit ALS-IgGs, dass diese Zellen möglicherweise nicht so reaktiv sind wie Astrozyten auf diese humoralen Faktoren der ALS-Entzündung. Mehrere Studien wurden mit primären Astrozyten aus ALS-Mausmodellen durchgeführt, nicht nur bei Welpen, sondern auch bei symptomatischen Tieren, entweder am Gehirn oder am Rückenmark 18,19,20,21. Dies gilt auch für mikrogliale Primärkulturen, wenn auch in geringerem Maße als Astrozyten und meist aus Hirnregionen im embryonalen Stadium^22,23,24.

Wir verwenden Zeitraffer-Videoaufnahmen von Ca²⁺ auf Zellen in Kultur hauptsächlich als Mittel, um intrazelluläre Transienten dieses Ions als physiologischen Marker für Exzitotoxizität zu verfolgen. So kann der Forscher durch biophysikalische Charakterisierung dieser Transienten (Amplitude, Fläche unter Transienten, Anstiegszeit, Frequenz) experimentelle diagnostische Parameter aus verschiedenen zellulären Modellen der Neurodegeneration erhalten. Diese Technik bietet somit den Vorteil einer quantitativen physiologischen Bewertung von IgGs als Krankheitsbiomarker. Es gibt eine große Menge an Literatur über die Rolle von IgGs und Ca²⁺ bei der Induktion von ALS. Die meisten dieser Studien wurden durchgeführt, indem ALS induziert wurde, indem Patienten-IgGs in Versuchstiere injiziert wurden 25,26,27,28,29^, die dann intrazelluläre Ca ²⁺-Erhöhung und IgG-Ablagerungen zeigten. Eine Reihe von Studien untersuchte die Wirkung von ALS-IgGs auf die motorische Synapse in vitro^30,31,32. Im obigen Kontext legt die hier vorgestellte Technik den Fokus auf die Gliazellen als wichtige Akteure im nicht-zellautonomen Mechanismus der ALS und quantifiziert ihre mögliche exzitotoxische Reaktion auf IgGs als humorale Faktoren der Neuroinflammation. Dieser Ansatz kann eine breitere Anwendung beim Testen anderer humoraler Faktoren wie ganze Seren, Liquor oder Zytokine in verschiedenen Zellkultursystemen und in zellulären Modellen allgemeiner Entzündungen haben.

Dieser Artikel beschreibt, wie Primärkulturen von Gliazellen, Astrozyten und Mikroglia aus den Kortices von Sprague Dawley-Ratten hergestellt werden können und wie diese Zellen weiter verwendet werden können, um die ALS-Pathophysiologie mit Patienten-Seren-abgeleitetem IgG zu untersuchen. Protokolle sind detailliert für die Farbstoffbeladung von kultivierten Zellen (Abbildung 1) und die Aufzeichnungen von Ca²⁺ Änderungen in Zeitraffer-Video-Imaging-Experimenten. Beispiele für Videoaufnahmen zeigen, wie Gliazellen auf ALS-IgG im Vergleich zu ATP reagieren, wobei letzteres purinerge Membranrezeptoren aktiviert. Zum ersten Mal wird ein Beispiel gezeigt, wie aus dem HSOD1^G93A ALS-Rattengehirn isolierte Astrozyten im Vergleich zu nicht-transgenen Kontrollen mit einer ausgeprägteren Ca 2+-Reaktion auf ALS-IgG reagieren und wie dieser Prozess mit den Unterschieden im Ca²⁺-Speicherbetrieb in Beziehung gesetzt werden kann. Ebenfalls gezeigt wird ein Beispiel für die Kalziumbildgebung in Mikrogliazellen, die akut mit ALS IgG herausgefordert wurden, mit nur einer bescheidenen Reaktion von intrazellulärem Kalzium.