أدت تقنيات زراعة الخلايا إلى العديد من التطورات في مجالات متنوعة من الفيزيولوجيا العصبية الخلوية في الصحة والمرض. على وجه الخصوص ، تسمح مزارع الخلايا الأولية ، المعزولة حديثا من الأنسجة العصبية لحيوان المختبر ، للمجرب بدراسة سلوك الخلايا المتنوعة عن كثب في وسائط كيميائية حيوية وإعدادات فسيولوجية مختلفة. يوفر استخدام مؤشرات فسيولوجية فلورية مختلفة مثل الأصباغ الحساسة ل Ca²⁺ مع الفحص المجهري بالفيديو بفاصل زمني رؤية أفضل للعمليات الفيزيائية الحيوية والكيميائية الحيوية الخلوية في الوقت الفعلي.

ALS هو مرض تنكسي عصبي مدمر يؤثر على الخلايا العصبية الحركية العلوية والسفلية¹. هذا المرض لديه إمراض معقد من النوع العائلي ولكن في الغالب من شكل متقطع (90 ٪ من الحالات)². من المعروف أن الآليات المستقلة غير الخلوية تساهم في الفيزيولوجيا المرضية لمرض التصلب الجانبي الضموري ، ويرجع ذلك أساسا إلى الدور الأساسي للخلايا الدبقية³. كما يتميز مرض التصلب الجانبي الضموري بأنه مرض التهابي عصبي مع تورط عوامل الالتهاب الخلطية والخلوية.

يستخدم الغلوبولين المناعي G على نطاق واسع كعلامة جزيئية في ALS والأمراض التنكسية العصبية الأخرى. يمكن أن تشير دراسة مستوى مصل هذه العلامة إلى وجود ومرحلة الالتهاب العصبي في المرض⁴،⁵،^{6 ،} في حين أن وجودها في السائل النخاعي يمكن أن يشير إلى خرق حاجز الدم في الدماغ⁷. تم تحديد IgGs أيضا كرواسب في الخلايا العصبية الحركية للحبل الشوكي لمرضى ALS⁷. ومع ذلك ، فقد أظهر هذا النهج بعض التناقضات في ارتباط مستوى IgGs بمرحلة وخصائص المرض⁶.

يمكن أن يؤدي IgG المعزول من أمصال مرضى ALS (ALS IgG) إلى استجابة الكالسيوم في الخلايا النجمية الساذجة⁸ وإطلاق الغلوتامات في الخلايا العصبية ، مما يشير إلى تأثير السمية المثيرة – وهي السمة المميزة لعلم أمراض ALS⁹. ومع ذلك ، أظهرت الدراسات التي أجريت على نموذج الفئران hSOD1^G93A ALS (الذي يحتوي على نسخ متعددة من طفرة SOD1 البشرية¹⁰) عددا من علامات الإجهاد التأكسدي في الخلايا العصبية المستزرعة 11 ، أو الأنسجة 12،13^،14 ، أو الحيوانات الحية ¹³. من الجدير بالذكر أن الخلايا النجمية المستزرعة من نموذج الفئران ALS كانت أكثر عرضة للإجهاد التأكسدي الناجم عن البيروكسيد من الخلايا النجمية من فضلات القمامة غير المعدلة وراثيا¹¹.

تتأثر الخلايا الدبقية الصغيرة في المزرعة ب ALS IgG بطريقة أقل وضوحا. وبالتحديد ، أظهر خط الخلايا الدبقية الصغيرة BV-2 ارتفاعا في الإشارة من علامات الفلورسنت للإجهاد التأكسدي استجابة لتطبيق عينات مرضى 4/11 ALS IgG فقط¹⁵. من المعروف أن الخلايا الدبقية الصغيرة تشارك في العديد من الأمراض الالتهابية العصبية ، مما يزيد من الإجهاد التأكسدي ومرحلة التقدم المتأخر في آلية مستقلة غير خلية من ALS^16،17. ومع ذلك ، أشارت البيانات مع ALS IgGs إلى أن هذه الخلايا قد لا تكون متفاعلة مثل الخلايا النجمية لهذه العوامل الخلطية لالتهاب ALS. تم إجراء العديد من الدراسات مع الخلايا النجمية الأولية من نماذج ALS الفئران ، ليس فقط في الجراء ولكن أيضا في الحيوانات التي تظهر عليها أعراض ، إما على الدماغ أو على الحبل الشوكي¹⁸،¹⁹،^20،21. وينطبق هذا أيضا على الثقافات الأولية الدبقية الصغيرة ، وإن كان بدرجة أقل من الخلايا النجمية ومعظمها من مناطق الدماغ في المرحلة الجنينية²²،^23،24.

نحن نستخدم تصوير فيديو الفاصل الزمني ل Ca²⁺ على الخلايا في الثقافة في المقام الأول كوسيلة لمتابعة العابرين داخل الخلايا لهذا الأيون كعلامة فسيولوجية للسمية الإثارة. وبالتالي ، من خلال التوصيف الفيزيائي الحيوي لهذه العابرين (السعة ، المنطقة تحت الزوال ، وقت الارتفاع ، التردد) يمكن للباحث الحصول على معلمات تشخيصية تجريبية من نماذج خلوية متنوعة للتنكس العصبي. وبالتالي ، توفر هذه التقنية ميزة التقييم الفسيولوجي الكمي ل IgGs كمؤشرات حيوية للمرض. هناك مجموعة كبيرة من الأدبيات حول دور IgGs و Ca²⁺ في تحريض ALS. تم إجراء معظم هذه الدراسات عن طريق تحفيز ALS عن طريق حقن المريض IgGs في التجارب²⁵،²⁶،^27،28،^{29 ،} والتي أظهرت بعد ذلك ارتفاع Ca ²⁺ داخل الخلايا وترسبات IgG. استكشفت مجموعة من الدراسات تأثير ALS IgGs على المشبك الحركي في المختبر³⁰،^31،32. في السياق أعلاه ، تركز التقنية المقدمة هنا على الخلايا الدبقية كلاعبين مهمين في الآلية المستقلة غير الخلوية ل ALS وتحدد استجابتها السمية المحتملة ل IgGs كعوامل خلطية للالتهاب العصبي. قد يكون لهذا النهج تطبيق أوسع في اختبار العوامل الخلطية الأخرى مثل الأمصال الكاملة أو السائل الدماغي الشوكي أو السيتوكينات في أنظمة زراعة الخلايا المختلفة وفي النماذج الخلوية للالتهاب العام.

تصف هذه الورقة كيفية تحضير الثقافات الأولية للخلايا الدبقية والخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة من قشرة فئران Sprague Dawley وكيفية استخدام هذه الخلايا بشكل أكبر لدراسة الفيزيولوجيا المرضية ALS باستخدام IgG المشتق من الأمصال للمريض. تم تفصيل البروتوكولات لتحميل صبغ الخلايا المستزرعة (الشكل 1) وتسجيلات تغييرات Ca²⁺ في تجارب تصوير الفيديو بفاصل زمني. ستوضح أمثلة تسجيلات الفيديو كيف تتفاعل الخلايا الدبقية مع ALS IgG مقارنة ب ATP ، حيث يقوم الأخير بتنشيط مستقبلات الغشاء البيورينجي. يظهر لأول مرة مثال على كيفية تفاعل الخلايا النجمية المعزولة من دماغ الفئران hSOD1^G93A ALS مع استجابة Ca 2+ أكثر وضوحا ل ALS IgG مقارنة بالضوابط غير المعدلة وراثيا وكيفية ربط هذه العملية بالاختلافات في تشغيل متجر Ca²⁺. يظهر أيضا مثال على تصوير الكالسيوم في الخلايا الدبقية الصغيرة التي تواجه تحديا حادا مع ALS IgG ، مع استجابة متواضعة فقط من الكالسيوم داخل الخلايا.