JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Biologia

Siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonu

Published: February 03, 2022
doi:
10.3791/63481
, , , , ,
1Department of Biological Sciences,Wellesley College, 2Departamento de Bioquímica y Biología Molecular, Campus de Excelencia Internacional, Agroalimentario,Universidad de Córdoba, 3i3S – Instituto de Investigação e Inovação em Saúde,Universidade do Porto, 4IBMC – Instituto de Biologia Molecular e Celular,Universidade do Porto, 5MCbiology Doctoral Program, ICBAS – Instituto de Ciências Biomédicas Abel Salazar,Universidade do Porto, 6Departamento de Biologia, Faculdade de Ciências,Universidade do Porto

Summary

Mevcut protokol, siyanobakteriyel kültürlerden hücre dışı veziküllerin izolasyonu, konsantrasyonu ve karakterizasyonu için ayrıntılı açıklamalar sunmaktadır. Vezikülleri farklı ölçeklerdeki kültürlerden arındırmaya yönelik yaklaşımlar, metodolojiler arasındaki ödünleşimler ve saha örnekleriyle çalışmak için dikkat edilmesi gerekenler de tartışılmaktadır.

Abstract

Siyanobakteriler, küresel ekosistemlerde kritik rol oynayan ve temel biyoteknoloji modelleri olarak hizmet eden çeşitli fotosentetik, Gram-negatif bakteri grubudur. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, hem deniz hem de tatlı su siyanobakterilerinin, mikropların dış yüzeyinden salınan küçük zara bağlı yapılar olan hücre dışı veziküller ürettiğini göstermiştir. Veziküller muhtemelen çeşitli biyolojik süreçlere katkıda bulunurken, siyanobakteriyel biyolojideki spesifik fonksiyonel rolleri büyük ölçüde bilinmemektedir. Bu alandaki araştırmaları teşvik etmek ve ilerletmek için, siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerin izole edilmesi, konsantre edilmesi ve saflaştırılması için ayrıntılı bir protokol sunulmaktadır. Mevcut çalışma, vezikülleri Prochlorococcus, Synechococcus ve Synechocystis’in büyük kültürlerinden başarıyla izole eden metodolojileri tartışmaktadır. Bu suşlardan vezikül örneklerini ölçmek ve karakterize etmek için yöntemler sunulmuştur. Vezikülleri sucul alan örneklerinden izole etmek için yaklaşımlar da açıklanmaktadır. Son olarak, siyanobakteriyel vezikül saflaştırma ile karşılaşılan tipik zorluklar, farklı aşağı akış uygulamaları için metodolojik hususlar ve yaklaşımlar arasındaki dengeler de tartışılmaktadır.

Introduction

Hücre dışı veziküller (EV’ler), çapı ~ 20-400 nm arasında değişen, neredeyse tüm organizmalar tarafından çevrelerinesalınan küresel yapılardır 1,2,3. Veziküller bir lipit çift katmanlı tarafından sınırlandırılır ve kendilerini kopyalayamazlar. Gram-negatif bakterilerde, bu yapıların öncelikle dış zardan küçük kısımların ‘ağartılması’ ile ortaya çıktığı düşünülmektedir. Yine de, kamçı hareketi, hücre lizisi ve hem iç hem de dış membran malzemesinin salgılanması gibi diğer işlemler de veziküller üretebilir 4,5. EV’ler, lipitler, çözünür ve membran proteinleri, nükleik asitler ve metabolitler dahil olmak üzere çeşitli biyomoleküller içerebilir ve bu materyalihücreler arasında taşıyabilir 4,5,6. Bu özellikler göz önüne alındığında, EV’ler hücresel iletişim, biyofilm oluşumu, yatay gen transferi, konakçı-faj dinamikleri ve besin değişimi 4,6 dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik süreçlerdeki olası rollerini anlamak için çalışılmaktadır.

Siyanobakteriler, tek hücreli ve filamentli organizmalar da dahil olmak üzere büyük ve çeşitli bir Gram-negatif bakteri grubudur. Fizyolojilerini ve çeşitliliklerini 7,8, hizmet ettikleri kritik ekosistem işlevlerini9,10 ve biyoteknoloji için faydalarını anlamak da dahil olmak üzere birçok açıdan ilgi çekicidirler 11,12. Siyanobakteriler, deniz, tatlı su ve karasal ortamlarda serbest yaşayan organizmalar olarak veya yosunlar, eğrelti otları, bitkiler veya likenler ve süngerler ile simbiyotik ilişkilerde çok çeşitli habitatlarda bulunur13. Sucul ekosistemlerde çok önemli birincil üreticiler olarak hizmet ederler, oksijenik fotosentez 9,10 yoluyla oksijen ve organik karbon üretirler ve bazıları atmosferik azotu da sabitleyebilirler7. Prochlorococcus, Synechococcus ve Synechocystis dahil olmak üzere deniz ve tatlı su siyanobakterileri, laboratuvar koşullarında EV’ler üretir 14,15,16 ve siyanobakteriyel veziküller doğal ortamlarda da bulunabilir14,17. Siyanobakteriyel veziküllerin biyolojik ve ekolojik fonksiyonları bilinmemektedir, ancak bu alandaki daha ileri araştırmaların, siyanobakteriyel fizyoloji, farklılaşma, iletişim stratejileri, evrim ve trofik etkileşimler hakkındaki sorulara yeni bakış açıları sağlaması muhtemeldir. Ek olarak, siyanobakteriyel EV’lerin çeşitli biyomolekül kategorilerini taşıma kabiliyetinin ticari uygulamaları olabilir18,19.

Bu protokol, siyanobakteriyel hücre dışı vezikül biyolojisinin daha geniş bir incelemesini sağlamak ve teşvik etmek için siyanobakteriyel kültürlerden ve saha örneklerinden vezikülleri izole etme ve karakterize etme yöntemlerini açıklamaktadır. Burada açıklanan iş akışı, EV’leri diğer bakterilerden izole etme ve karakterize etme protokollerine benzer olsa da, siyanobakteriyel kültürler ve saha örnekleri tipik olarak konakçı ile ilişkili veya patojenik model sistemlerinde yaygın olarak gözlenenden daha düşük hücre ve vezikül konsantrasyonları içerir20,21,22. Bu nedenle, siyanobakteriyel EV’lerin çalışmaları, suşlar ve medya geçmişleri arasında daha fazla farklılık gösteren ekim ve vezikül izolasyonu için özel hususlar ve optimizasyonlar gerektirir. Tek bir protokol tüm suşlar, büyüme koşulları ve aşağı akış uygulamaları için eşit derecede iyi çalışmayacağından, araştırmacıların deneysel sorularını ele almak için en uygun yaklaşımları belirleyebilmeleri için birden fazla seçenek sunarız ve ilgili ödünleşimleri tartışırız.

Protocol

Siyanobakteriyel suşlar çeşitli kültür koleksiyonlarından elde edilir (ayrıntılar için Tartışma’ya bakınız). 1. Siyanobakteriyel yetiştiriciliği Aşağıdaki adımları izleyerek deniz siyanobakterileri Prochlorococcus ve Synechococcus’u yetiştirin. Prochlorococcus ve Synechococcus suşlarını polikarbonat şişelerde Pro99 veya SN gibi uygun bir ortam kullanarak yetiştirin (bkz. Ayrıntılar için lütfen daha önce yayınlanmış Referanslar 23,24’e bakınız. Kültürleri, deney için gerekli olan istenen sıcaklık ve ışıma koşulları altında iki ila üç transferde (her geçiş için taze ortama 1:20 kültür seyreltmesi) büyüterek iklimlendirin.NOT: Tipik büyüme koşulları23,25, 8-150 μmol fotonlar m-2 s-1 arasındaki ışımada 15-30 °C arasındaki sıcaklıkları içerir, ancak bireysel gerinim toleransları ve optima büyük ölçüde değişir 26 ve ilgili kültür toplama talimatlarının veya literatürün rehberliğine dayanarak ayarlanması gerekir. Kültür floresansı veya akış sitometrisi23 sayısını kullanarak büyüme hızını izleyin ve deneye başlamadan önce kültürlerin tutarlı bir kararlı durum üstel oranında büyümesini sağlayın. Hücreler geç üstel faza ulaştığında daha küçük hacimlerden daha büyük hacimlere bir dizi ardışık kademeli transfer gerçekleştirin (örneğin; 20 mL < 250 mL < 2 L < 10 L < 20 L).NOT: Büyük hacimli kültürler, az miktarda başlangıç kültüründen doğrudan aşılanamaz. Daha büyük kültürlerin, ek sodyum bikarbonat ile birlikte tamponların (1 mM HEPES, pH 7.5 veya 3.75 mM TAPS, pH 8 gibi) eklenmesini veya steril hava24 ile köpürtülmesini gerektirebileceğini unutmayın. Tatlı su yetiştiriciliği siyanobakteri Synechocystis sp. PCC 6803. Synechocystis sp. PCC 6803 kültürünü, havalandırma (1 L / dak’da köpüren hava), 30 ° C’de, 16 saatlik bir ışık altında (50 μmol m-2 s-1 foton sayısı) / 8 saat karanlık rejim altında, BG11 orta27’de 1.0 (üstel faz) 730 nm’de (OD730) optik yoğunluğa kadar yetiştirerek inokülum olarak kullanılmak üzere hazırlayın. Bu kültürün 30 mL’sini aşılayın Synechocystis sp. PCC 6803, 570 mL BG11 ortamında, 1 L cam gaz yıkama şişelerinde 0.05’lik bir OD730’a kadar. Hücrelerin havalandırma ile, 30 ° C’de, 16 saatlik bir ışık altında (foton sayısı 50 μmol m-2 s-1) / 8 saat karanlık rejim altında, 1.0-1.5’lik son OD730’a kadar büyümesine izin verin. 2. Siyanobakteriyel biyokütlenin küçük parçacık (vezikül) fraksiyonundan ayrılması NOT: İlk olarak, hücrelerin süpernatanttan ayrılması, hücrelerin santrifüjlü peletlenmesi yoluyla tavsiye edilir. Bununla birlikte, kültür hacimleri bunun mümkün olamayacak kadar büyük olduğunda, santrifüjlemeyi atlamak ve kapsül filtrasyonu kullanarak doğrudan tüm kültürleri filtrelemeye devam etmek mümkündür (adım 2.4). Ayrı hücrelere santrifüjleme yapın (mevcut santrifüj kapasitesine bağlı olarak ~ 4 L’ye kadar olan hacimler için en iyisi). Santrifüj şişelerini Tip I ultra saf sınıf su kullanarak otoklav yapın veya iyice yıkayın ve temizleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), artık sabun veya başka bir malzeme kalmamasını sağlayın. Kültür numunelerini uygun sayıda santrifüj şişesine yükleyin ve dengeleyin. 10 dakika boyunca 4 °C’de >10.000 x g için spin kültürleri. Süpernatant gözle görülür şekilde bulanık kalırsa, santrifüjleme koşullarını maksimum hızda 20 dakikaya çıkarın ve yeniden deneyin. Süpernatantı temiz bir kaba dikkatlice boşaltın veya pipetleyin ve adım 2.2-2.4’te belirtilen aşağıdaki filtreleme seçeneklerinden birine geçin. Seçenek 1: 0,2 μm filtreler kullanarak şırınga filtrasyonu gerçekleştirin (~ 50 mL’ye kadar numune hacimleri için). Steril bir 50 mL’lik şırıngayı büyük ölçüde hücresiz bir kültür ortamıyla doldurun ve 0,2 (veya 0,45) μm polieter sülfon (PES) filtresinden süzün (bkz. Filtreyi temiz, sterilize edilmiş bir kapta toplayın. Filtre tıkanana kadar bu adımı tekrarlayın (örneğin, şırıngayla itmek zorlaşır). Yeni bir filtreyle değiştirin ve numune iyice filtrelenene kadar devam edin. Seçenek 2: 0,2 μm vakum filtreleme gerçekleştirin (~ 4 L’ye kadar). Vakum aparatını Tip I – ultra saf sınıf su kullanarak iyice yıkayın ve temizleyin, bir vakum tutucusuna ve pompaya bağlayın ( bkz. Uygun çapta 0,2 μm’lik bir filtre takın ve vakum aparatını kelepçeleyin. Vakum basıncının <10 psi kalmasını sağlamak için az miktarda kültür örneği ekleyin. Tamamlanana kadar kültürü küçük artışlarla filtrelemeye devam edin. Filtrasyon hızı önemli ölçüde yavaşlarsa, vakumu durdurun ve filtreyi değiştirin. Veziküller içeren <0,2 μm fraksiyonunu temiz bir kapta toplayın. Seçenek 3: 0,2 μm kapsül filtrasyonu gerçekleştirin (numune hacimleri >~4 L) Uygun büyüklükte esnek boru ve toplama kabını su ve hafif deterjanla yıkayarak temizleyin. Malzemeyi damıtılmış ve deiyonize suyla durulayın.NOT: Kullanmadan önce, malzeme Tip I – ultra saf sınıf su ile durulanmalıdır. Filtrelenecek kültürü, aşağıdaki son toplama kabı ile güvenli, yükseltilmiş bir yere yerleştirin. 0,2 μm’lik bir kapsül filtre (bkz. Malzeme Tablosu) çıkış portunu tek parça boruya bağlayın ve bir toplama kabına yerleştirin. Numuneye başka bir boru yerleştirin, bir şırınga ile boruya bir miktar numune çekerek bir yerçekimi sifonuna başlayın ve boruyu kapsül filtreye bağlayın. Fazla havayı serbest bırakmak ve odayı süpernatant ile doldurmak için havalandırma deliğini kullanın. Numune iyice filtrelenene kadar malzemenin kapsül boyunca hareket etmesine izin verin. Akış hızı çok yavaşlarsa (başlangıç akış hızının <~1/10’u veya sürekli akan bir akışın aksine damla yönünde dışarı çıkarsa), karşı basınç artana kadar peristaltik bir pompa ile bekleyin veya yumuşak bir kuvvet uygulayın. Alternatif olarak, filtrenin bağlantısını geçici olarak keserek, biriken biyokütleyi giriş tarafından ultra temiz suyla geri yıkayarak ve malzeme artık gözle görülür şekilde bulanık hale gelene kadar akış hızlarını kısmen geri kazanın ve ardından filtreleme işlemini yeniden başlatın. 3. Vezikül örneğinin konsantre edilmesi Seçenek 1: Küçük (<500 mL) hacimli numuneleri konsantre etmek için santrifüjlü ultrafiltrasyon gerçekleştirin. Tercih edilen 15-20 mL ultrafiltrasyon santrifüjlü konsantratörleri Tip I – ultra saf dereceli su ile durulayın. Konsantratörleri santrifüje yükleyin ve 4 ° C’de 4.400 x g’de döndürün. Çalıştırmayı atın ve bu adımı en az iki kez daha tekrarlayın. Süpernatant numuneyi suyla durulanmış konsantratörlere yükleyin ve aynı koşullar altında döndürün. Deneysel hedeflere bağlı olarak, numune filtrasyonu daha fazla konsantrasyon (nominal moleküler ağırlık sınırı 3 kDa’lık olan konsantratörlerle) ve analiz için atılabilir, toplanabilir. Numune ~ 15-30 mL’lik bir son hacme konsantre olana kadar bu adımı tekrarlayın. Seçenek 2: Büyük (>500 mL) bir numune hacmini yoğunlaştırmak için teğetsel akış filtrasyonu (TFF) gerçekleştirin. TFF aparatını üreticinin yönergelerine göre ayarlayın (bkz. Giriş hattına peristaltik bir pompa takın ve ayarlanabilir kelepçeleri retentat hattına yerleştirin. TFF’yi üretici tarafından önerildiği gibi sterilize edin ve ardından cihazı 1 L Tip I – ultra saf sınıf su ile yıkayın.NOT: Giriş ve retentat hatları temiz bir numune haznesine (cam şişe) yerleştirilmelidir. Filtrat hat(lar)ı bir atık kabına veya lavaboya yönlendirilmelidir. Numune haznesine <0,2 μm filtrasyon ekleyin. Filtrat hatlarından çıkışı artırmak için retentate hattındaki pompa hızını ve karşı basınç seviyelerini yavaşça artırın. TFF’yi çalıştırmaya devam edin, malzeme çıkarıldıkça rezervuarı kültür süpernatant ile doldurun. Hava kabarcıklarının oluşmasını önlemek için işleme sırasında emme hattının numuneden çıkmasına izin vermekten kaçının. Besleme basıncının ~ 10 psi’yi geçmediğinden ve retentatın TFF’den rezervuara tutarlı bir hızda geri aktığından emin olun. Rezervuardaki hacim, hava kabarcıkları sokmadan giriş hattına akışı sürdürmek için gereken mümkün olan en düşük miktara ulaştığında numuneyi yoğunlaştırmayı bırakın. Çıkış çizgisini bir kelepçe ile kapatın. Retentat hattındaki karşı basıncı kaldırın ve konsantre süpernatantı filtreden ~ 10 dakika boyunca yeniden dolaştırın, böylece geri kazanımı en üst düzeye çıkarmak için devridaim hızını 20-40 mL / dak’ya düşürün. Retentat hattını temiz bir kaba taşıyın, giriş hattını numuneden çıkarın ve konsantre malzemeyi toplayın. Pipet kullanarak numune haznesinde kalan malzemeleri geri kazanın. Hiçbir hücrenin kalmadığından emin olmak için konsantre süpernatantı 0,2 μm’lik bir şırınga filtresinden (adım 2.2) süzün.NOT: Adım 3.2.7 isteğe bağlıdır. Gerekirse, vezikül saflaştırmaya geçmeden önce son konsantreyi ~ 3 hafta boyunca 4 ° C’de saklayın (adım 4). 4. Vezikül izolasyonu ve saflaştırma Aşağıdaki adımları izleyerek doğrudan ultrasantrifüjleme ile pelet. Konsantre <0,2 μm kültür numunesini temiz bir ultrasantrifüj tüpüne yerleştirin. Tüpün tamamen dolduğundan emin olmak için gerektiğinde temiz ortam veya tampon ekleyin.NOT: Son kültür numunesi bir tüpe sığmayacak kadar büyükse, malzemeyi yıkama adımlarından önce birleştirilecek birden fazla tüp halinde pelet veya aynı tüpte seri olarak pelet edin. Gerekirse, bir denge oluşturun ve 4 ° C’de 3 saat boyunca ~ 100.000 x g’de döndürün. Süpernatantı bir pipetle dikkatlice çıkarın. Siyanobakteriyel vezikül peletleri bir miktar renklenme gösterebilirken, sıklıkla görünmezdir. Peletlenmiş malzemeyi, ultrasantrifüj tüpüne taze kültür ortamı veya 1x fosfat tamponlu salin (PBS) gibi yıkama tamponu ekleyerek yıkayın ( Tartışmaya bakınız), nazik pipetleme ile karıştırın ve adım 4.1.2’deki gibi tekrar döndürün. Yıkama işlemini ikinci kez tekrarlayın. Son peleti taze kültürde tekrar tekrar ama nazikçe 1 mL’lik bir pipetle tüpün dibinde yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden askıya alın. Temiz bir gemiye aktarın. Yoğunluk gradyanı ultrasantrifüjleme gerçekleştirin. Örnek için istenen tampon arka planının 4x konsantre versiyonunu yaparak iyodiksanol stokları hazırlayın (bkz. % 45’lik bir iyodiksanol çözeltisi oluşturmak için 4x tamponunun bir kısmını% 60 iyodiksanol stoğundan oluşan üç parça ile karıştırın. , , , , , ve nihai iyodiksanol konsantrasyonlarında gradyan ortam stokları oluşturmak için iyotiksanol hacimlerini 1x tampon hacimleriyle seyreltin.NOT: Gerekli toplam miktar, ultrasantrifüj rotorunun/borularının kapasitesine göre değişecektir. Tüpün tüm hacminin kullanılacağı şekilde, eşit miktarlarda% 45,% 40,% 35,% 30,% 25,% 20,% 15,% 10 ve% 0 ioksidinol’ü bir ultrasantrifüj tüpüne dikkatlice biçerek bir ultrasantrifüj yoğunluk gradyanı ayarlayın.NOT: Saflaştırılacak hücre dışı vezikül örneği,% 0 iyodiksanol tabakasının bir parçası olarak gradyanın üstüne yerleştirilmelidir. Vezikül numunesinin son hacmi% 0 katmanının boyutunu aşarsa, herhangi bir fazla vezikül numunesini% 10 veya daha yüksek konsantrasyonlu optiprep stoklarının gerekli hacmini oluşturmak için% 45 iyotiksanol ve / veya tampon ile karıştırın ve bunları gradyandaki ilgili yerde kullanın. Degradeyi 6 saat boyunca 4 ° C’de ~ 100.000 x g’de döndürün. Kesirleri (tipik olarak ~4,5 mL’lik bir gradyan için her biri 0,5 mL) dikkatli pipetleme veya kesir toplayıcı kullanarak toplayın (bkz. Bilinen bir numune hacminin ağırlığını ölçmek için analitik terazi ve kalibre edilmiş pipet kullanarak her fraksiyonun yoğunluğunu (g/mL cinsinden) belirleyin. Numuneyi tüpten çıkarın, ağırlığı belirleyin ve numuneyi doğrudan iade edin. Tek tek fraksiyonları temiz tamponlu yeni bir ultrasantrifüj tüpünde seyreltin ve malzemeyi 4.1.2-4.1.4 adımlarında belirtildiği gibi yıkayın. Alternatif olarak, parçacıkları kurtarmak için diyaliz veya ultrafiltrasyon sütunları kullanın.NOT: Siyanobakteriyel hücre dışı veziküller tipik olarak iyodiksanolde ~ 1.14-1.19 g / mL’lik yüzdürme yoğunluklarına göç eder. Vezikülleri 1-3 hafta içinde kullanılacaksa 4 ° C’de saklayın. Vezikülleri -20 °C veya -80 °C’de dondurun, eğer bu süreden daha uzun süre kullanılmazlarsa. 5. İzole veziküllerin karakterizasyonu Negatif leke geçiren elektron mikroskobu yapın (bakınız Malzeme Tablosu) (TEM; partikül boyutu, yapısı, saflığı). Görüntü kalitesini artırmak için, eski kaplamalı bir TEM ızgarasının yüzeyini, üreticinin yönergelerine göre bir kızdırma boşaltma sistemi kullanarak parlatma deşarjı yapar (bkz. Vezikül örneğinin ~ 5 μL’sini dikkatlice uygulayın ve 5 dakika bekletin.NOT: Vezikül konsantrasyonları >109 mL-1 olan numuneler tipik olarak en iyi sonuçları verecektir; daha seyreltik örnekler görüntü başına birkaç veziküle sahip olacaktır. Bir ızgaranın kenarına bir parça temiz filtre kağıdına dokunarak numuneyi çıkarın. Pipet% 2 uranil asetattan 20-50 μL’lik bir damla ( Malzeme Tablosuna bakınız) plastik filmle kaplı düz bir yüzeye yerleştirin ve ızgarayı 2 dakika boyunca üzerine yerleştirin. Filtre kağıdı kullanarak uranil asetatı çıkarın ve yıkamak için bir damla ultra saf su üzerinde kısa bir süre yüzün. Su yıkamayı ikinci kez tekrarlayın.NOT: Son kuru ızgara, adım 5.1.5’ten sonra görselleştirmeye hazırdır. TEM için ultra ince kesit boyama işlemi gerçekleştirin (partikül boyutu, iç yapı). Peleti adım 4.1.5’ten 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda (pH 7) 1 mL% 2.5 glutaraldehit ile yeniden askıya alın (bkz. Malzeme Tablosu) ve numuneyi 4 °C’de 2 saat sabitleyin. 4 ° C’de 1 saat boyunca ~ 100.000 x g’de döndürün. Peleti 0,1 M sodyum kakodilat tamponu (pH 7) ile dikkatlice yıkayın ve ardından 4 ° C’de 1 saat boyunca ~ 100.000 x g’de döndürün. Peleti 1 saat boyunca 1 mL% 1 osmiyum tetroksit ( Malzeme Tablosuna bakınız) (0.1 M sodyum kakodilat tamponunda hazırlanmış) ile sabitleyin ve ardından adım 5.2.3’teki gibi yıkayın. Numuneyi, 4 ° C’de her biri 10 dakikalık adımlarla 1 mL yükselen bir etanol serisi (% 50,% 70,% 90 ve mutlak etanolde iki kez) ile kurutun. Pelet üzerine mutlak etanol (1:1) ile karıştırılmış 250 μL epoksi reçine ( bakınız Malzeme Tablosu) ekleyin ve gece boyunca 4 ° C’de inkübe edin. Peletin 24 saat boyunca 500 μL saf reçineye aktarılması. Daha sonra, reçineyi 48 saat boyunca 65 ° C’de inkübe edin.NOT: Reçine artık üreticinin talimatlarını izleyerek ultramikrotom ile bölümlemeye hazırdır (bkz. %2 uranil asetat içeren kesitleri içeren ızgaraları ( etanol içinde) 5 dakika boyunca sabitleyin. Slaytları, her biri 10-15 s boyunca akan deiyonize su altında yavaşça yıkayın. Bir damla kurşun sitrat yerleştirin ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve 5 dakika daha lekeleyin. Daha önce olduğu gibi yıkayın, ızgarayı bir filtre kağıdına lekeleyerek suyu çıkarın ve ızgaraları havayla kurulayın. Üreticinin yönergelerine göre TEM tarafından görselleştirin (bkz. Nanopartikül izleme analizi (NTA) yapın (partikül boyutu, konsantrasyon). Lens kağıdı kullanarak, optik düzlükteki tozları veya görünür malzemeleri dikkatlice silin. Tüm O-ringlerin ve diğer contaların temiz ve sağlam olup olmadığını kontrol edin. Cihazı açın ve yazılımı başlatın. Temiz bir şırınga kullanarak, odayı ultra saf suyla doldurun. Hava kabarcığı olmadığından emin olun. Kamerayı Başlat’a tıklayın ve odanın ‘parmak izi’ ile ilgili en uygun bölgesini görselleştirin. Mikroskop aşamasını gerektiği gibi yatay veya dikey olarak ayarlayın, böylece sinyal yoğunluğu görüntülenen bölgede bile olur. Görüntüleme bölgesini parmak izine göre yatay olarak hareket ettirin (sağda, dikey çizgiye doğru), yakınlarda düşük arka plan sinyaline sahip bir bölge bulun. Ekran Kazancı ve Kamera Düzeyi kaydırıcılarını maksimuma kaydırın ve ardından en soluk parçacıkları görmek için en düşük düzeye düşürün.NOT: Siyanobakteriyel veziküller için tipik ayarlar, 10-12 arasında bir Ekran Kazancı ve Kamera Seviyesi kullanır. Parçacıkların görüş alanı boyunca kabaca eşit derecede görünür olmasını sağlamak için odağı gerektiği gibi ayarlayın. Odanın temiz olduğunu görsel olarak onaylayana kadar odadan ultra temiz su itmeye devam edin. Farklı bir şırınga kullanarak odadan kalan suyu çıkarın. Temiz bir 1 mL şırınga kullanarak odayı ortam/tamponla doldurarak arka plan partikül konsantrasyonunu belirlemek için numunenizin içinde bulunduğu ortam/tamponun bir örneğini inceleyin. SÇP açılır kutusundan Standart ölçüm’ü seçin. Her biri 60 s videodan oluşan en az üç teknik kopya toplamak için ayarları değiştirin. Create and Run Script (Komut Dosyası Oluştur ve Çalıştır) düğmesine basın ve istemleri izleyin. ~100 μL numuneyi replikalar arasındaki odaya itin. Alım tamamlandığında, kalan tamponu bir şırınga ile çıkarın, 3-5 mL ultra saf suyu odadan yıkayın ve kalan suyu çıkarın. Vezikül örneğini 1 mL’lik bir şırınga kullanarak odaya ekleyin ve alım ayarlarını onaylayın. Partikül sayısı cihazın doğrusal aralığında değilse (tipik olarak 20-80 parçacık/çerçeve arasında), numunenin seyreltilmesi veya konsantre edilmesi gerekecektir. Veri toplamadan önce odaya en az 500 μL numune itin. Adım 5.3.8’deki gibi video verilerini toplayın ve odayı farklı numuneler arasında ultra saf suyla temizlediğinizden emin olun. Verilerin karşılaştırılabilirliğini sağlamak için aynı organizmadan/deneyden sonraki tüm örnekleri aynı kamera ayarlarını kullanarak toplamak; Kamera Düzeyi ayarındaki değişiklikler, elde edilen son değerler üzerinde kayda değer bir etkiye sahip olabilir. Yazılımın analiz bölümünü kullanarak partikül parametrelerini belirleyin. Analizi > Denemeyi Aç’ı seçin ve örnek dosyayı yükleyin. Seçili Dosyaları İşle’yi seçin ve analizin tamamlanmasını bekleyin. Aynı deneyden sonraki tüm örnekler için aynı Algılama Eşiğini kullandığınızdan emin olun.NOT: Siyanobakteriyel veziküller sıklıkla loş olduğundan, Algılama Eşiğinin tipik olarak en hassas (en düşük) değere ayarlanması gerekecektir. Dinamik ışık saçılımı (DLS) gerçekleştirin (parçacık boyutu, zeta potansiyeli). Ölçümlere müdahale eden büyük parçacıkları taramak için DLS’ye giren herhangi bir numune için 0,2 μm gözenek boyutunda bir filtreden süzün. Ortamdan gelen olası agregasyonları veya diğer nanopartikülleri incelemek için temiz bir küvete 1 mL ortam / tampon ekleyin. Küvetin sol tarafındaki buzlu tarafı mikro numune alma cihazına koyun ve kapağı kapatın. Numunenin en az 5 dakika dengelenmesine izin verin. Malzemenin kırılma indisini ve su için varsayılanlardan önemli ölçüde farklıysa malzeme absorpsiyonunu girin.NOT: Veziküller 100 nm’den küçükse malzeme özelliklerinin çok az etkisi olacaktır. EV’lerin yüzey potansiyelini (zeta potansiyeli) ölçerken, veziküller orijinal büyüme ortamında yeniden askıya alınmalıdır. Okumaları kontrol etmek ve yeşil simgeye tıklayarak veri toplamayı başlatmak için Gösterge Kontrol Paneline tıklayın. Değerler iyi görünüyorsa ve ortamınız / arabelleğiniz toplamalar veya diğer parçacıklar içermiyorsa, artık numunenizi ölçmeye hazırsınız demektir. Temiz bir küvete 1 mL vezikül örneği ekleyin ve adım 5.4.4’te belirtildiği gibi veri toplayın. Her biri 10 dakika boyunca en az üç teknik kopya toplayın. Numunede Gram-negatif EV’lerin bulunduğunu doğrulamak için lipopolisakkarit (LPS) analizi yapın. Standart 1x Laemmli numune tamponunda 95 °C’de ekstraktüre vezikül numunesini 10 dakika ısıtın (bkz. Kirletici glikoproteinleri uzaklaştırmak için 37 ° C’de Streptomyces griseus’tan 0.2 U tip XIV proteaz ile inkübe edin ( Malzeme Tablosuna bakınız). Daha önceyayınlanan protokol 16’yı takiben% 16 (w / v) SDS-poliakrilamid jelleri denatüre etme üzerine elektroforez ile ayrı işlem görmüş numuneler. LPS’yi tespit etmek için, jeli ticari olarak temin edilebilen boyama kitleriyle veya modifiye edilmiş gümüş boyama tekniği28 ile boyayın. Daha önce yayınlanmış Referanslar 29,30’a göre boyalı jellerin dansitometri analizi ile göreceli LPS bolluğunu ölçün. 6. Vezikül üretim hızı ölçümleri Adım 5.3’teki gibi nanopartikül izleme analizini veya eşdeğer teknolojiyi kullanarak, deney için büyüme ortamındaki parçacık konsantrasyonunu ölçün. Yüksek partikül sayısı bulunursa, 0,1 μm’lik bir gözenek filtresinden süzün ve tekrar kontrol edin.NOT: Hatayı en aza indirmek için, ortam arka plan partikül konsantrasyonu, en düşük yoğunluktaki kültürlerde bulunan partikül konsantrasyonunun% 10’undan az olmalıdır. Adım 1.1.2’de olduğu gibi deneyler için istenen ortam ve çevre koşulları altında en az iki ardışık seri transfer için hücreleri büyüterek kültürü iklimlendirin. Kültürlerin hala üstel büyüme aşamasındayken aktarılması gerekir. Ölçülen kültür büyüme oranlarının transferler arasında tutarlı olmasını sağlamak; değilse, büyüme oranları tekrarlanabilir olana kadar kültürleri aktarmaya devam edin. Aşılama üzerine zaman kursu örnekleri toplayın ve büyüme eğrisi boyunca erken durağan faza kadar düzenli aralıklarla zamanlanmış aralıklar toplayın. Üstel büyümenin tüm aralığında toplanan en az 3-4 örneğe sahip olmak için şaşırtıcı zaman noktaları. Her zaman noktasında örnekleme yapmak için aşağıdaki adımları gerçekleştirin. 1 mL veya daha fazla kültürü doğrudan temiz, steril 0,2 μm şırınga filtresinden filtreleyin ve adım 5.3’te olduğu gibi vezikül konsantrasyonunu ölçmek için filtrattan tasarruf edin. İsterseniz zaman kursu örneklerini dondurun. Kültür büyüme dinamiklerini takip etmek için göreceli floresan kullanın. Organizma için uygun bir yöntem kullanarak popülasyon büyüklüğünü belirlemek için tüm kültürün bir örneğini kaydedin (akış sitometrisi; koloni kaplaması; veya başka türlü). Her zaman noktasında hücrelerin ve vezikül benzeri parçacıkların (mL başına) ölçümlerini alın. Üstel büyüme aşamasında meydana gelen zaman noktalarını tanımlayın. R’yi hesaplamak için, üstel büyüme sırasında iki nokta arasında (tipik olarak zaman seyrinin başlangıcı ve sonu) nesil başına hücre başına üretilen vezikül sayısı, Ek Dosya 1’de sağlanan denklemi kullanın.NOT: Bu yöntem yalnızca kararlı durum büyüme koşulları sırasında geçerlidir; Hesaplamanın altında yatan varsayımlar ve türev Referans14’te detaylandırılmıştır.

Representative Results

Şekil 1, siyanobakteriyel vezikül izolasyon sürecine genel bir bakış sunarak, burada açıklanan protokolün temel yönlerini vurgulamaktadır. Siyanobakteriyel biyokütlenin küçük parçacık (vezikül) fraksiyonundan ayrılmasını, vezikül örneğini yoğunlaştırmayı ve vezikül izolasyonunu ve saflaştırmasını (Şekil 1, adım 2 ila 4) detaylandıran adımlar, veziküllerin tekrarlanabilir preparatlarını elde etmek için kritik öneme sahiptir. Şekil 2, siyanobakteri Synechocystis sp. PCC 6803’ten hücre dışı veziküllerin izolasyonu ve karakterizasyonundan temsili sonuçlar sunmaktadır. Bu siyanobakterinin dış zarının, ultrasantrifüjleme yoluyla doğrudan peletleme yoluyla toplanan vezikül örneklerine karakteristik turuncu renklenme sağlayan karotenoidler31 içerdiği gösterilmiştir (Şekil 2A). Vezikül peleti yeniden askıya alındıktan sonra, veziküller transmisyon elektron mikroskobu (TEM), uranil asetat ile numunelerin negatif boyanması (Şekil 2B) veya ultra ince kesitlerin gözlemlenmesi (Şekil 2C) ile incelenebilir. Vezikül boyutu dağılımı ve konsantrasyonu, dinamik ışık saçılması (DLS) (Şekil 2D) ve nanopartikül izleme analizleri (NTA) (Şekil 2E) kullanılarak değerlendirilebilir. Tarif edilen protokolle, mL başına tipik olarak ~ 3.5 ± 1.0 x 108 nanopartikül, 1.0’lık bir OD730’da üstel olarak büyüyen bir Synechocystis sp. PCC 6803 kültüründe elde edildi. İzole edilmiş veziküllerin fiziksel karakterizasyonunu tamamlamak için izole EV’lerin biyokimyasal analizleri yapılabilir. Örnek olarak, saflaştırılmış Synechocystis sp. PCC 6803 vezikülleri bir SDS-poliakrilamid jel üzerinde ayrıldı ve lipopolisakkaritler (LPS; Şekil 2F). LPS dış membran32’ye özgü olduğundan, LPS tespiti membrana bağlı veziküllerin varlığını doğrulayabilir ve aynı suş33’ten preparatlar arasındaki göreceli vezikül içeriğini analiz etmek için bir belirteç görevi görebilir. Düşük ve yüksek moleküler ağırlıklı LPS’lerin göreceli bolluğunun incelenmesi, numuneler arasındaki vezikül bileşimindeki değişiklikleri gösterebilir34,35. Şekil 1: Siyanobakteriyel EV izolasyonu ve karakterizasyonu için kullanılan deneysel prosedürler. Büyüyen kültürlerin şematik gösterimleri (1) ve siyanobakteriyel biyokütlenin büyüme ortamından ayrılması (2). Veziküller içeren hücresiz örnekler konsantre edilir (3) ve daha sonra EV’ler izole edilir ve saflaştırılır (4). Uygulamaya bağlı olarak, vezikül preparatları, iletim elektron mikroskobu (TEM), nanopartikül izleme analizi (NTA), dinamik ışık saçılması (DLS) ve lipopolisakkarit (LPS) profillemesinin bir veya bir kombinasyonu kullanılarak karakterize edilebilir (5). RT, oda sıcaklığı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Şekil 2: Siyanobakteri Synechocystis sp. PCC 6803 için hücre dışı vezikül izolasyonu ve karakterizasyonunun temsili sonuçları. (A) Konsantre hücresiz hücre dışı ortamın ultrasantrifüjlenmesinden sonra elde edilen hücre dışı vezikül peletinin (EVs peleti) fotoğrafı, 600 mL Synechocystis sp. PCC 6803 kültüründen 1.0-1.5’lik bir OD730’a büyütüldü. Dış zarda bulunan karotenoidlerden türetilen vezikül peletinin tipik turuncu renklenmesine dikkat edin. (B,C) Synechocystis sp. PCC 6803 vezikül örneklerinin negatif boyanmış (B) ve ultra ince kesitlerinin (C) transmisyon elektron mikroskobu (TEM) fotoğrafları. Ölçek çubukları: sırasıyla 200 nm ve 50 nm. Örnekler, 80 kV’ta çalıştırılan bir transmisyon elektron mikroskobu üzerinde görselleştirildi. (D) Vezikül hacminin dağılımını vezikül çapının bir fonksiyonu olarak gösteren tipik dinamik ışık saçılması (DLS) grafiği (nm cinsinden). Renkli çizgiler, aynı numunenin üç teknik çoğaltma ölçümünden elde edilen verileri gösterir. (E) Synechocystis hücre dışı vezikül boyutu dağılımının temsili nanopartikül izleme analizi (NTA) verileri (nm cinsinden). Siyah çizgi üç teknik kopyanın ortalamasını gösterir ve kırmızı çizgiler ortalamanın standart hatasını temsil eder. (F) Lipopolisakkaritler (LPS) profili, vezikül preparatının (w/v) SDS-poliakrilamid jel üzerinde elektroforez ile ayrılması ve ticari bir LPS boyama kiti ile boyanmasından sonra tespit edilmiştir. Sırasıyla kaba ve pürüzsüz LPS formlarına karşılık gelen düşük ve yüksek moleküler ağırlıklı LPS tespit edilebilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın. Ek Dosya 1: R hesaplanacak denklem. Üstel büyüme sırasında iki nokta arasında nesil başına hücre başına üretilen vezikül sayısı (tipik olarak zaman akışının başlangıcı ve sonu) bu denklem kullanılarak belirlenir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.

Discussion

Dikkat edilmesi gereken genel noktalar
Protokol (Şekil 1), siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerle çalışmak için ‘herkese uyan tek beden’ bir yöntem olmadığını vurgulamak için bir dizi seçenek olarak sunulmaktadır. İlgilenen araştırmacılar, bu protokolün kendi model organizmaları, deneysel sorular / hedefler ve ekipman kullanılabilirliği için uyumlu ve uygun olan bölümlerini kullanabilirler. Tüm vezikül izolasyon yaklaşımları değiş tokuşlar içerir ve kaçınılmaz olarak bir dereceye kadar önyargı ile sonuçlanacaktır. Mümkün olduğunda bunu en aza indirmeye çalışmak gerekirken, en önemli husus, kullanılan ayrıntılı metodolojinin uygun MISEV (Hücre Dışı Vezikül Çalışmaları için Minimal Bilgi) kılavuzlarına göre rapor edilmesini sağlamaktır36.

Kültür gelişimi
Siyanobakteriyel kültürler, dünya çapında mevcut olan birçok kültür koleksiyonundan birinden kolayca elde edilebilir. Birkaç örnek Roscoff Kültür Koleksiyonu (Station Biologique de Roscoff, Fransa), Pasteur Kültür Koleksiyonu (Institute Pasteur, Paris, Fransa) ve Provasoli-Guillard Ulusal Deniz Algleri ve Mikrobiyota Merkezi (NCMA, Maine, ABD). Tercih edilen siyanobakteriyel suş, farklı suşlar arasında önemli ölçüde değişen, uygun ortam ve çevre koşullarında yetiştirilmelidir. Siyanobakteriyel yetiştiriciliği için yaygın olarak kullanılan medyanın bir listesi, kültür koleksiyonu web sitelerinde veya diğer yayınlarda bulunabilir37,38,39.

Siyanobakteriyel hücre dışı veziküllerle çalışmak, birçok tipik model laboratuvar heterotrofları için bildirilen metodolojilerle karşılaştırıldığında bazı benzersiz zorluklar ortaya koymaktadır. Siyanobakteriyel kültürler, Escherichia coli14,16,40 gibi diğer mikroplarda bulunanlardan daha düşük büyüklükte vezikül konsantrasyonlarına sahiptir. Muhtemelen daha düşük hücre yoğunluklarından ve / veya vezikül üretim oranlarından kaynaklanan bu farklılıklar, kütle analizleri için yeterli malzeme üretmek için nispeten büyük kültürlerin (~ 1-20 L veya daha fazla) gerekli olabileceği anlamına gelir. Bu nedenle, araştırmacılar, istenen nihai hedeflerine ulaşmak için ne kadar malzemenin gerekli olacağını belirlemek için daha küçük ölçekli kültürlerden vezikül verimlerini test etmeye teşvik edilmektedir. Deney için kullanılan ortamın tespit edilebilir bir partikül arka planına sahip olup olmadığını belirlemenin önemi, herhangi bir deneye başlamadan önce de vurgulanmalıdır, çünkü bu malzeme potansiyel olarak vezikül popülasyonu nicelleştirmesini karıştırabilir, vezikül konsantrasyonu / boyut ölçümlerinin hassasiyetini azaltabilir veya nihai vezikül preparatlarını kirletebilir.

Alan için bir başka zorluk, tüm siyanobakterilerin saf kültürde iyi büyümemesi veya hiç büyümemesidir. Aksenik hale getirilene kadar, fiziksel vezikül özelliklerinin, üretim oranlarının veya içeriklerinin yorumlanması, toplumdaki herhangi bir suş tarafından üretilen veziküller hakkında net sonuçlara yol açamaz. Araştırmacılara ayrıca, farklı parçacık türleri arasında mutlaka ayrım yapamayan belirli nanopartikül analiz araçlarıyla başka hangi parçacık türlerinin mevcut olabileceğini ve potansiyel olarak veziküllerle karıştırılabileceğini düşünmeleri önerilir. Örneğin, kullanılan suşun genom dizilimi, indüksiyon tahlilleri veya diğer yollarla bir profajdan yoksun olduğunu veya diğer partikül madde türlerini serbest bırakmadığını doğrulamak gerekli olabilir. Deneyimlerimize göre, çoğu siyanobakteriyel vezikül <0.2 μm çapındadır, ancak yeni bir gerinim veya büyüme durumuna bakıldığında, 0.45 μm gözenek boyutunda bir filtre kullanmanın saflaştırılmış parçacıkların boyut dağılımını değiştirip değiştirmediği doğrulanmalıdır.

Kültür koşullarının birçok yönü vezikül üretimini ve içeriğini etkileyebilir41,42. Bu nedenle, kültür büyümesi için kullanılan fiziksel ve kimyasal koşulların (ışık ışınımı, sıcaklık ve ortam bileşimi dahil), sonuçların tekrarlanabilirliğini sağlamak için mümkün olduğunca belgelenmesi ve kontrol edilmesi gerekir. Vezikül içeriğinin herhangi bir kimyasal analizi, özellikle ‘-omics’ tarzı yüksek verimli analizler yapılırken, arka plan bileşimini hesaba katmalıdır. Bu, doğal bir deniz suyu arka planına dayanan veya maya özü veya tripton ile desteklenenler gibi tanımlanmamış ortamlar kullanıldığında özellikle kritik olabilir. Tanımlanmış bir büyüme ortamının kullanılması, deneysel hedeflere bağlı olarak tercih edilebilir.

Araştırmacıların, belirli bir parti kültürünün büyüme aşamasında nerede olduğunu bildiklerinden ve sadece keyfi bir süre sonra numune toplamadıklarından emin olmak için kültür büyüme dinamiklerini düzenli aralıklarla dikkatlice izlemeleri gerekir. Vezikül bileşimi büyüme fazları arasında, özellikle üstel ve durağan fazlar arasında değişebilir41,42. Örneğin, durağan fazda örneklenen veziküllerin en azından bir kısmı, üstel büyüme sırasında gerçekleşmeyecek olan hücre lizisi gibi farklı bir hücresel mekanizmadan kaynaklanabilir. Bu hala büyük biyolojik ilgi çekici olsa da, numuneyi bilmek önemlidir. Bir siyanobakteriyel kültür, doğrudan numune konsantrasyonuna ilerlemenin mümkün olmadığı bir zamanda istenen büyüme aşamasına ulaşırsa, hücrelerin derhal <0.2 μm fraksiyonundan ayrılması (santrifüjleme ve / veya doğrudan 0.2 μm filtrasyon ile) ve ardından hücresiz filtrasyonun 4 ° C'de saklanması önerilir. Malzeme, veziküllerin konsantrasyonu veya boyut dağılımı üzerinde çok az veya hiç fark edilmeyen bir etkisi olan günlerce bu şekilde saklanabilir.

Vezikül saflaştırmaları
Vezikülleri önemli hacimli kültürlerden izole etme ihtiyacı, siyanobakteriyel vezikül izolasyon iş akışında hayati öneme sahiptir. Daha büyük hacimli malzemelerle çalışırken, veziküllerin aşağı akış ayırma iş akışlarından önce konsantre edilmesi gerekecektir. Nominal moleküler ağırlık sınırı 100 kDa’ya sahip konsantratörler (teğetsel akış filtresi membranları veya santrifüj kolonlar), konsantrasyon sürelerini makul tutarken düşük moleküler ağırlığa sahip çözünür malzemeden ayrılmaya izin verdikleri için genellikle tavsiye edilir, ancak 30 kDa filtreler de sıklıkla başarı ile kullanılır. Vezikülleri saflaştırmak için ultrasantrifüjleme tabanlı olmayan birkaç yöntem (örneğin, boyut dışlama kromatografisi, mikroakışkan tabanlı sistemler, afinite yakalama teknikleri ve yağış bazlı yaklaşımlar) hücre dışı vezikül alanında popüler hale gelirken, deneyimlerimize göre, bu yaklaşımlar verimin düşmesine neden olabilir ve tipik olarak ihtiyaç duyulan kültür hacimleriyle uyumsuzdur.

Araştırmacılar, istenen aşağı akış uygulamalarıyla uyumlu olduklarından emin olmak için iyotiksanol arka planının bileşimini ve vezikül saflaştırma sırasında kullanılan yıkama / yeniden süspansiyon tamponlarını göz önünde bulundurmalıdır. Çoğu durumda, son vezikül örneği, büyüme ortamında veya bileşimde büyüme ortamıyla karşılaştırılabilir tanımlanmış bir tamponda (örneğin, doğal ve yapay deniz suyu) yeniden askıya alınabilir. Bununla birlikte, bu, analiz için daha fazla deneysel manipülasyon gerektirecek olan deniz siyanobakteriyel vezikülleri ile mümkün olmayabilir, çünkü deniz suyu seviyelerine benzer yüksek tuz konsantrasyonları birçok enzimatik reaksiyonu inhibe edebilir. Bu gibi durumlarda, 0,2 μm filtrelenmiş, 1x PBS gibi standart laboratuvar tamponları tipik olarak deniz siyanobakteriyel veziküllerinin stabilitesini korumak için iyi çalışır ve aşağı akış deneysel işlemleriyle daha uyumlu olabilir.

Yoğunluk gradyanı saflaştırma, deneysel hedeflere ve kültür bileşimine bağlı olarak isteğe bağlı olarak düşünülebilir, ancak daha titiz bir şekilde saf ve tekrarlanabilir bir numune üretmek için şiddetle tavsiye edilir. EV popülasyonları heterojendir ve gerinim, büyüme koşulları ve diğer faktörlere göre daha da değişen bir dizi kaldırma yoğunluğunda bulunabilir 4,5,6. Yukarıda listelenen yoğunluklar, tipik olarak siyanobakteriyel kültürlerden veziküller ve iyodiksanoldeki alan örneklerinden bulunanları temsil eder, ancak diğer suşlarla sonuçlanabilir. Sakkaroz ve CsCl gibi diğer yoğunluk gradyanı malzemeleri veziküller için kullanılabilir, ancak bu arka planlarda farklı yüzdürme yoğunluklarına göç ederler. Farklı gradyan ortam arka planları, lipid ile çevrili virüslerin43 geri kazanımını önleyebilir ve farklı suşlardan veziküllerin iyileşmesini potansiyel olarak etkileyebilir.

Veziküller, vezikül izolasyonu ve burada açıklanan gradyan saflaştırma işlemi yoluyla birden fazla noktada kaybedilebilir, bu da verimleri azaltır ve aşağı akış uygulamaları için belirli bir nihai vezikül verimi elde etmek için gereken başlangıç malzemesi miktarını arttırır. Ultrasantrifüjlemeyi takiben vezikül peletleri ile çalışırken özel dikkat gösterilmelidir. Bazı siyanobakteriyel veziküller, vezikül örneklerine bir miktar pigmentasyon ödünç verebilecek karotenoidlere veya diğer bileşiklere sahip olsa da (Şekil 2), malzemenin gerinimine veya miktarına bağlı olarak, vezikül peletini doğrudan görselleştirebilmeleri beklenmemektedir. Pelet nerede verilmesi beklendiğinin farkında olun, kullanılan santrifüj rotorunun tipi. Mümkün olduğunda, saflaştırılmış vezikül numunelerinin, geri kazanılan nihai malzemenin bileşimini doğrulamak için elektron mikroskobu ile incelenmesi önerilir.

Depolama koşullarının veziküller ve içerikleri üzerindeki etkisi açık bir soru olmaya devam etmektedir. Depolamanın siyanobakteriyel vezikül boyutu veya konsantrasyonu14 üzerinde kayda değer bir etkisi olmadığı bulunmasına rağmen, izole vezikül preparatlarının işlevselliği zamanla değişebilir44. Donma/çözülme döngülerinden mümkün olduğunca kaçınılması gerekirken, numunelerin dondurulmasının genel vezikül sayıları ve boyutları üzerindeki etkisi minimum düzeyde görünmektedir. Donma-çözülme döngülerinin, vezikülle ilişkili nükleik asitlerin uzunluğu veya proteinlerin stabilitesi gibi vezikül içeriğinin bileşimini etkileme potansiyelinin farkında olunmalıdır.

f ield samples’den veziküller
Hücre dışı vezikülleri doğal su ortamlarından izole etmek için mevcut yöntemler, kavramsal ve operasyonel olarak burada büyük hacimli kültürler için tarif edilenlere benzer. Yine de, daha büyük miktarlarda malzeme gerektirebilirler. Bu tür saha numuneleri, analiz için yeterli malzeme elde etmek için yüzlerce ila binlerce litre suyun toplanmasını, filtrelenmesini ve konsantrasyonunu içerebilir. Kullanılan numunenin bulanıklığına bağlı olarak, 0,2 μm filtreden önce bir veya daha fazla ön filtreleme adımının dahil edilmesi gerekebilir. Kullanılan spesifik TFF cihazı, bu kadar büyük hacimlerle makul bir süre içinde (ideal olarak saat sırasına göre) ve numuneye aşırı baskı uygulamadan çalışmak için uygun olmalıdır. Uygulamada, bu genellikle kültür bazlı numunelere uygulanabilecek olandan çok daha büyük bir toplam yüzey alanının yanı sıra artan akış hızlarını kolaylaştırmak için daha büyük çaplı borular kullanmayı içerir. Bu artan filtre yüzey alanı, daha küçük TFF düzenlemelerine ve daha büyük bir nihai konsantre hacmine kıyasla partikül kayıplarında marjinal bir artışa yol açacaktır; ancak, bu endişeler toplam işlem süresi ile dengelenmelidir. Numunelerin örneklemeden sonraki günler boyunca laboratuvara geri dönmeyeceği genişletilmiş bir oşinografik seyir gibi durumlar için, sahada ilk 0,2 μm filtreleme ve TFF adımlarını gerçekleştirmenizi öneririz. Bu daha küçük hacimli konsantre malzeme daha sonra son işleme için laboratuvara iade edilene kadar gemide 4 °C veya -80 °C’de (kullanılabilirliğe ve aşağı akış analitik hususlarına bağlı olarak) saklanabilir.

Hücre dışı veziküllerin hem organik hem de inorganik diğer küçük parçacıklardan izolasyonu ve ayrılması zor olabilir ve farklı parçacıkları ayırma yöntemleri henüz mükemmel değildir. Örneğin, iyotiksanol yoğunluk gradyanları, belirli bir örnekte bulunan tüm vezikül ve virüs sınıflarını kolayca ayıramayabilir. Kafa karıştırıcı parçacıkların türleri ve fiziksel özellikleri, örnekleme alanları arasında değişeceğinden, küçük su parçacıklarının tüm sınıflarını sağlam bir şekilde bölecek bir protokol sağlamak şu anda imkansızdır. Deneme yanılma esastır ve ayırmayı en üst düzeye çıkarmak için gradyan ve ultrasantrifüjleme koşullarında kullanılan iyodiksantol aralığı ile deney yapılması gerekecektir; daha küçük hacimli, daha ince çözümlenmiş yoğunluk fraksiyonlarından oluşan bir koleksiyon da gerekli olabilir. İçeriğe bağlı olarak, iyodiksanol yerine CsCl gradyanlarının kullanılması, çevresel parçacıkların ayrılmasına yardımcı olabilir45. Yine de, ozmotik koşullardaki değişiklik, yukarıda tartışıldığı gibi, nihai geri kazanılan ürünlerde önyargılara yol açabilir.

Vezikül karakterizasyonu
Nanopartikül analiz cihazları henüz mikrobiyoloji laboratuar ortamlarında rutin olarak mevcut değildir, ancak giderek daha fazla kullanılabilir hale gelmektedir. Tüm metodolojilerin artıları ve eksileri vardır ve siyanobakteriyel vezikül çalışması için bir platformun diğerlerinden daha iyi olduğu konusunda spesifik bir onay vermeyiz; Gerçekten de, hepsinin maliyetler, çözünürlük, kullanım kolaylığı, algılama sınırları, farklı büyüme ortamı / arabellek arka planlarıyla uyumluluk ve veri tekrarlanabilirliği ile ilgili belirli ödünleşimleri vardır. Yukarıda açıklanan nanopartikül izleme analizine dayanan cihazlara ek olarak, nanoflow sitometrisi, mikroakışkan rezistif darbe algılama ve ayarlanabilir rezistif darbe algılama dahil olmak üzere diğer yaklaşımlar uygulanabilir46,47. Kullanıcılar, mevcut enstrümantasyonlarının ayrıntılarını öğrenmeye ve sistemleriyle iyi çalıştığını doğrulamaya dikkat etmelidir, çünkü bazı platformları deniz suyu bazlı ortamlarla kullanırken zorluklarla karşılaştık. Alanı, vezikül boyutunun, konsantrasyonlarının ve üretim oranlarının nicel karakterizasyonuna doğru ilerlemeye teşvik ediyoruz. Vezikül konsantrasyonlarının protein içeriği veya diğer metrikler açısından değil, mL bazında temel bir parçacık bazında ölçülmesi, veziküllerin daha nicel çerçevelere entegrasyonuna izin verecek ve suşlar ve koşullar arasında karşılıklı karşılaştırmalar yapılmasını sağlayacaktır. <100nm parçacıklar için konsantrasyon ölçümlerini kalibre etme yeteneğini geliştirmek için daha fazla çabaya ihtiyaç vardır.

Vezikül üretim hızı ölçümlerinin, partikül kayıplarını en aza indirmek için doğrudan 0,2 μm filtrelenmiş kültür süpernatantından yapılması, yukarıda açıklanan diğer saflaştırma adımlarıyla ilişkili olacaktır. Bununla birlikte, bu, yaklaşımın gerçek hücre dışı veziküller ile kültürlerde bulunan diğer küçük parçacıklar arasında ayrım yapmadığı anlamına gelir. Sadece belirli boyut aralıklarındaki parçacıkları saymak (örneğin, 50-250 nm çap) bazı aykırı değerlerin dışlanmasına yardımcı olabilir, ancak peletlenmiş <0.2 μm kültür içeriğinin membrana bağlı veziküller (TEM veya diğer yaklaşımlarla) gibi göründüğünün görsel olarak doğrulanması, vezikül benzeri parçacıkların üretiminin aksine veziküllerin üretimini ölçtüğünü özel olarak iddia edebilmek için gereklidir.

Vezikül karakterizasyonunda önemli bir faktör, vezikül numunesinin nanopartikül analiz cihazının uygun doğrusal hassasiyet aralığında analiz edilmesini sağlamaktır. Bir numune çok konsantre olduğunda, bu malzemeyi temiz bir tamponla seyreltmek ve yeniden analiz etmek kolaydır. Öte yandan, bazı siyanobakteriyel kültürlerin nispeten düşük hücre ve / veya vezikül yoğunluğu, bazen bazı aletlerin tespit sınırlarının altında olan vezikül preparatları verebilir. Bunun dökme vezikül saflaştırmaları ile meydana geldiği durumlarda, daha büyük hacimli kültürlerin büyütülmesi, nihai malzemenin daha küçük bir hacimde yeniden peletlenmesi ve yeniden sulanması veya izolasyon işleminde aşırı kayıpların meydana geldiği ve hafifletilebileceği bir adım olup olmadığının değerlendirilmesi düşünülebilir. Vezikül üretim hızlarını ölçerken, düzeltmeler mutlaka o kadar basit değildir. Gerekirse numuneler konsantre edilebilir, ancak birincisi, ortamdaki ayarlamaların daha yüksek hücre yoğunluklarına neden olup olmayacağını veya konsantrasyonların daha yüksek olacağı üstel fazda daha sonraki zaman noktalarından yeterince konsantre numunelerin elde edilip edilemeyeceğini görmelidir.

Sınırlama
Herhangi bir protokolde olduğu gibi, bu yaklaşımları kullanan vezikül izolasyonunun da açık sınırlamaları vardır. Bu yaklaşımlar, veziküllerin tamamen saf bir şekilde hazırlanmasının izole edileceği garantisine dayanmaz. Hem kültürler hem de saha örnekleri, yoğunluk gradyanlarındaki veziküllere benzer şekilde göç eden başka malzemeler içerebilir. Yine de, en azından, bu tür ek arıtma metodolojileri, vezikül analizinin titizliğini ve tekrarlanabilirliğini sağlamak için gereklidir. Vezikül izolasyon yaklaşımlarını siyanobakteriler bağlamında tanımlarken, diğer birçok mikrobun kültürleri de nispeten düşük konsantrasyonlarda veziküller içerecektir ve burada açıklanan prosedürler genel olarak uygulanabilir olmalıdır. Bu yöntemlerin kalıcı bir protokol olarak değil, bunun yerine çeşitli mikroplardan hücre dışı veziküllerle çalışmada gelecekteki ilerlemeleri teşvik etmek için bir başlangıç noktası olarak hizmet etmesi beklenmektedir. Bu yöntemleri, farklı küçük parçacık kategorilerinin kültürlerden ve çevresel örneklerden ayırt edilmesini ve ayrılmasını iyileştirmek için boyut dışlama sütunları veya asimetrik alan akışı fraksiyonasyonu gibi diğer yaklaşımlarla birleştirmek için gelecekteki çabalar gereklidir. Ayrıca, bu tekniklerin, vezikül popülasyonlarındaki heterojenliği, içeriklerini ve çevredeki tam işlevsel rollerini inceleme yeteneğini geliştirmek için nanopartikül karakterizasyon teknolojilerindeki gelişmelerle birlikte gelişmeye devam edebileceğinden de umutluyuz.

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, i3S Bilimsel Platformları “Biyoarayüzler ve Nanoteknoloji” ve ulusal altyapı Portekiz Biyogörüntüleme Platformu’nun (PPBI-POCI-01-0145-FEDER-022122) bir üyesi olan “Histoloji ve Elektron Mikroskobu” nun desteğini kabul etmektedir. Ayrıca, TEM için ultra ince kesit boyama protokolünü optimize etmeye yardımcı olduğu için Prof. J. A. Gonzalez-Reyes’e (Córdoba Üniversitesi, İspanya) ve nanopartikül izleme analizi için Dr. Cecília Durães ve Dr. Ana Rita Pinto’ya (Porto Üniversitesi, Portekiz) teşekkür ederiz.

Bu çalışma, ABD Ulusal Bilim Vakfı (OCE-2049004’ten SJB’ye), Fundo Europeu de Desenvolvimento Bölgesel (FEDER) fonları tarafından COMPETE 2020 Operacional Rekabetçilik ve Uluslararasılaşma Programı (POCI), Portekiz, 2020 ve Portekiz fonları tarafından Fundação para a Ciência e a Tecnologia/Ministério da Ciência, Tecnologia e Ensino Superior tarafından POCI-01-0145-FEDER-029540 (PTDC/BIA-OUT/29540/2017 to PO) projesi çerçevesinde finanse edilmiştir. Fundação para a Ciência e a Tecnologia, doktora bursu SFRH / BD / 130478 / 2017 (SL) ve FCT Investigator hibesi IF / 00256 / 2015 (PO) için de büyük ölçüde kabul edilmektedir. M.C.M.-M. Horizon 2020 Çerçeve Programı (H2020-MSCA-IF-2018-RI-844891) kapsamında Marie Skłodowska-Curie Bireysel Bursu (Yeniden Entegrasyon paneli) tarafından desteklenmiştir.

Materials

1x Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Home-made buffer — Standard wash/storage buffer which can be used with vesicles; can be made in lab or purchased commercially
2% Uranyl acetate solution Electron Microscopy Sciences 22400-2 Negative staining – TEM
4x Laemmli Sample Buffer Bio-Rad 161-0747 Denaturation of vesicle sample prior to proteolysis, required for lipopolysaccharides (LPS) staining
Amicon Ultra Centrifugal Filters (100 kDa) Merck UFC9100XX Alternative option for centrifugal ultrafiltration
BG11 medium Home-made medium — Medium for cultivation of Synechocystis sp. PCC 6803
Carbon Support Film 200 Mesh, copper. CF200-Cu Electron Microscopy Sciences 71150 Transmission electron microscopy (TEM) grid
easiGlow Glow Discharge Cleaning System Ted Pella 91000 Commercial TEM grid glow discharger
EMbed 812 epoxy resin Electron Microscopy Sciences 14120 Ultra-thin sections – TEM
Filter holder for vacuum system Thermo Fisher Scientific 300-4000 Reusable units with filter membrane support plates
Glutaraldehyde  Grade I Sigma-Aldrich G5882-10X1ml Ultra-thin sections – TEM
HEPES [N-(2-Hydroxyethyl)piperazine-N′-(2-ethanesulfonic acid) sodium salt] Sigma-Aldrich H7006 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Lead Citrate, Trihydrate Electron Microscopy Sciences 17800 Stain for use in electron microscopy
Macrosep Advance Centrifugal Devices with Omega Membrane 100K Pall MAP100C36 For centrifugal ultrafiltration of small volume samples
Millipore Pellicon 3 TFF Module EMD Millipore XX42P0060 or XX42P0080 Alternative TFF option for concentrating large volume samples
Milli-Q Reference Water Purification System Merck Z00QSV0WW Water purification system for obtaining type I ultrapure grade water
NanoSight Malvern Panalytical LM14 or NS300 Nanoparticle tracking analysis
Optima L80 XP Ultracentrifuge Beckman Coulter L80 XP Ultracentrifuge (or similar model)
OptiPrep / Iodixanol Sigma-Aldrich D1556 Density gradient media
Osmium Tetroxide Reagent Plus Sigma-Aldrich 201030 Ultra-thin sections – TEM
Pall Centramate PE TFF holder Pall Corporation FS002K10 TFF module good for concentrating 10s-100s of L of sample; requires additional 30 or 100 kDa filter modules to scale with your estimated volumes
Peristaltic pump Masterflex L/S Cole-Parmer 07559-07 Pump for driving large-scale TFF modules
Piston Gradient Fractionator Biocomp Instruments 152-001 Automated density gradient fractionation
Polycarbonate tubes for the 70 Ti rotor Beckman Coulter 355618 Reusable ultracentrifuge polycarbonate aluminum tubes with cap assembly
Pro99 medium Home-made medium — Medium for cultivation of Prochlorococcus
Pro-Q Emerald LPS Gel Stain Kit Thermo Fisher Scientific P20495 LPS staining
SN medium Home-made medium — Medium for cultivation of cyanobacterial marine strains such as Synechococcus
Sodium cacodylate trihydrate Sigma-Aldrich C0250-100G Buffering agent in the preparation of vesicles samples for TEM
SW32Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 369650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~40 mL tubes; good for pelleting of bulk material
SW60Ti swinging bucket rotor Beckman Coulter 335650 Ultracentrifuge rotor, holds 6x ~4.5 mL tubes; good for gradient purifications and final vesicle washes
Syringe 1mL Luer BD Plastipak 303172 For vesicle isolation and loading samples into nanparticle tracking analysis (NTA) equipment
Syringe filter 0.2 µm Pall Corporation 4602 For vesicle isolation from cultures
TAPS [N-[Tris(hydroxymethyl)methyl]-3-aminopropanesulfonic acid] Sigma-Aldrich T5130 Buffering agent for cyanobacterial growth media
Transmission electron microscope JEOL JEM-1400 Or similar microscope
Type 70 Ti Fixed-Angle Titanium Rotor Beckman Coulter 337922 Ultracentrifuge rotor, holds 8x ~39 mL tubes; good for pelleting of bulk material
Type XIV protease from Streptomyces griseus Sigma-Aldrich P5147 Enzyme for proteolysis of EVs proteins, required for LPS staining
UltraClear tubes for the SW32Ti rotor Beckman Coulter 344058 Single use ultracentrifuge tubes
UltraClear tubes for the SW60Ti rotor Beckman Coulter 344062 Single use ultracentrifuge tubes
Ultramicrotome PowerTome XL, PT-PC RMC Products,  Boeckeler Instruments 75501 Microtome for ultra-thin sections – TEM
Universal 320 R centrifuge Hettich Z654736 This or any similar general-purpose benchtop/floor standing centrifuge can be used for pelleting cells
Vacuum apparatus KNF Neuberger N026.3 AT.18 Or any similar vacuum pump and trap
Vivaflow 200 100,000 MWCO PES Sartorius VF20P4 TFF module, good for 2-3L. You can connect different modules for higher volume (figure 1).
Whatman Polycap TC Capsule filter (0.2/0.2µm) Cytiva 6717-9502 Capsule filter for filtering large volumes of liquid
Zetasizer Malvern Panalytical Zetasizer Nano ZS Dynamic light scattering (DLS) instrument
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  2. van Niel, G., D’Angelo, G., Raposo, G. Shedding light on the cell biology of extracellular vesicles. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 19 (4), 213-228 (2018).
  3. Coelho, C., Casadevall, A. Answers to naysayers regarding microbial extracellular vesicles. Biochemical Society Transactions. 47 (4), 1005-1012 (2019).
  4. Schwechheimer, C., Kuehn, M. J. Outer-membrane vesicles from Gram-negative bacteria: biogenesis and functions. Nature Reviews Microbiology. 13 (10), 605-619 (2015).
  5. Toyofuku, M., Nomura, N., Eberl, L. Types and origins of bacterial membrane vesicles. Nature Reviews Microbiology. 17 (1), 13-24 (2019).
  6. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological Functions and Biogenesis of Secreted Bacterial Outer Membrane Vesicles. Annual Review of Microbiology. 64 (1), 163-184 (2010).
  7. Berman-Frank, I., Lundgren, P., Falkowski, P. Nitrogen fixation and photosynthetic oxygen evolution in cyanobacteria. Research in Microbiology. 154 (3), 157-164 (2003).
  8. Flores, E., Herrero, A. Compartmentalized function through cell differentiation in filamentous cyanobacteria. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 39-50 (2010).
  9. Flombaum, P., et al. Present and future global distributions of the marine cyanobacteria Prochlorococcus and Synechococcus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (24), 9824 (2013).
  10. Biller, S. J., Berube, P. M., Lindell, D., Chisholm, S. W. Prochlorococcus: the structure and function of collective diversity. Nature Reviews Microbiology. 13 (1), 13-27 (2015).
  11. Abed, R. M. M., Dobretsov, S., Sudesh, K. Applications of cyanobacteria in biotechnology. Journal of Applied Microbiology. 106 (1), 1-12 (2009).
  12. Lea-Smith, D. J., et al. Editorial: Exploring the growing role of cyanobacteria in industrial biotechnology and sustainability. Frontiers in Microbiology. 12, 1963 (2021).
  13. Garcia-Pichel, F., Zehr, J. P., Bhattacharya, D., Pakrasi, H. B. What’s in a name? The case of cyanobacteria. Journal of Phycology. 56 (1), 1-5 (2020).
  14. Biller, S. J., et al. Bacterial vesicles in marine ecosystems. Science. 343 (6167), 183 (2014).
  15. Pardo, Y. A., Florez, C., Baker, K. M., Schertzer, J. W., Mahler, G. J. Detection of outer membrane vesicles in Synechocystis PCC 6803. FEMS Microbiology Letters. 362 (20), (2015).
  16. Oliveira, P., et al. The versatile TolC-like Slr1270 in the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803. Environmental Microbiology. 18 (2), 486-502 (2016).
  17. Biller, S. J., et al. Membrane vesicles in sea water: heterogeneous DNA content and implications for viral abundance estimates. The ISME Journal. 11 (2), 394-404 (2017).
  18. Yin, H., et al. Synechococcus elongatus PCC7942 secretes extracellular vesicles to accelerate cutaneous wound healing by promoting angiogenesis. Theranostics. 9 (9), 2678-2693 (2019).
  19. Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Extracellular vesicles: An overlooked secretion system in cyanobacteria. Life. 10 (8), 129 (2020).
  20. Gupta, S., Marcela Rodriguez, G. Isolation and characterization of extracellular vesicles produced by iron-limited mycobacteria. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (152), e60359 (2019).
  21. Jung, A. L., et al. Legionella pneumophila outer membrane vesicles: Isolation and analysis of their pro-inflammatory potential on macrophages. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (120), e55146 (2017).
  22. Fantappiè, L., et al. Antibody-mediated immunity induced by engineered Escherichia coli OMVs carrying heterologous antigens in their lumen. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  23. Moore, L. R., et al. Culturing the marine cyanobacterium Prochlorococcus. Limnology and Oceanography: Methods. 5 (10), 353-362 (2007).
  24. Rippka, R., et al. Prochlorococcus marinus Chisholm et al. 1992 subs. Pastoris subs. nov. Strain PCC 9511, the first axenic chlorophyll a2/b2-containing cyanobacterium (Oxyphotobacteria). International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 50 (5), 1833 (2000).
  25. Moore, L. R., Chisholm, S. W. Photophysiology of the marine cyanobacterium Prochlorococcus: Ecotypic differences among cultured isolates. Limnology and Oceanography. 44 (3), 628 (1999).
  26. Partensky, F., Blanchot, J., Vaulot, D., Charpy, L., Larkum, A. W. D. . Bulletin de l’Institut Océanographique de Monaco, (n spécial 19). , 457-475 (1999).
  27. Stanier, R. Y., Kunisawa, R., Mandel, M., Cohen-Bazire, G. Purification and properties of unicellular blue-green algae (order Chroococcales). Bacteriological Reviews. 35 (2), 171-205 (1971).
  28. Fomsgaard, A., Freudenberg, M. A., Galanos, C. Modification of the silver staining technique to detect lipopolysaccharide in polyacrylamide gels. Journal of Clinical Microbiology. 28 (12), 2627-2631 (1990).
  29. Abràmoff, M. D., Magalhães, P. J., Ram, S. J. Image processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
  30. Peterson, T. Densitometric analysis using NIH image. North American Vascular Biology Organization (NAVBO) eNewsletter. 16 (3), (2010).
  31. Jürgens, U. J., Weckesser, J. Carotenoid-containing outer membrane of Synechocystis sp. strain PCC6714. Journal of Bacteriology. 164 (1), 384-389 (1985).
  32. Whitfield, C., Trent, M. S. Biosynthesis and export of bacterial lipopolysaccharides. Annual Review of Biochemistry. 83 (1), 99-128 (2014).
  33. McBroom, A. J., Johnson, A. P., Vemulapalli, S., Kuehn, M. J. Outer membrane vesicle production by Escherichia coli is independent of membrane instability. Journal of Bacteriology. 188 (15), 5385-5392 (2006).
  34. Kadurugamuwa, J. L., Beveridge, T. J. Virulence factors are released from Pseudomonas aeruginosa in association with membrane vesicles during normal growth and exposure to gentamicin: a novel mechanism of enzyme secretion. Journal of Bacteriology. 177 (14), 3998-4008 (1995).
  35. Nguyen, T. T., Saxena, A., Beveridge, T. J. Effect of surface lipopolysaccharide on the nature of membrane vesicles liberated from the Gram-negative bacterium Pseudomonas aeruginosa. Journal of Electron Microscopy. 52 (5), 465-469 (2003).
  36. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
  37. Norena-Caro, D. A., Malone, T. M., Benton, M. G. Nitrogen sources and iron availability affect pigment biosynthesis and nutrient consumption in Anabaena sp. UTEX 2576. Microorganisms. 9 (2), 431 (2021).
  38. Rippka, R. Isolation and purification of cyanobacteria. Methods in Enzymology. , 3-27 (1988).
  39. Van Alphen, P., Abedini Najafabadi, H., Branco dos Santos, F., Hellingwerf, K. J. Increasing the photoautotrophic growth rate of Synechocystis sp. PCC 6803 by identifying the limitations of its cultivation. Biotechnology Journal. 13 (8), 1700764 (2018).
  40. Reimer, S. L., et al. Comparative analysis of outer membrane vesicle isolation methods with an Escherichia coli tolA. mutant reveals a hypervesiculating phenotype with outer-inner membrane vesicle content. Frontiers in Microbiology. 12 (383), (2021).
  41. Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209 (2019).
  42. Soares, N. C., et al. Associating growth-phase-related changes in the proteome of Acinetobacter baumannii with increased resistance to oxidative stress. Journal of Proteome Research. 9 (4), 1951-1964 (2010).
  43. Thurber, R. V., Haynes, M., Breitbart, M., Wegley, L., Rohwer, F. Laboratory procedures to generate viral metagenomes. Nature Protocols. 4 (4), 470-483 (2009).
  44. Dell’Annunziata, F., et al. Outer membrane vesicles derived from Klebsiella pneumoniae are a driving force for horizontal gene transfer. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), 8732 (2021).
  45. Linney, M. D., Schvarcz, C. R., Steward, G. F., DeLong, E. F., Karl, D. M. A method for characterizing dissolved DNA and its application to the North Pacific Subtropical Gyre. Limnology and Oceanography: Methods. 19 (3), 210-221 (2021).
  46. Arab, T., et al. Characterization of extracellular vesicles and synthetic nanoparticles with four orthogonal single-particle analysis platforms. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (6), 12079 (2021).
  47. Cimorelli, M., Nieuwland, R., Varga, Z., vander Pol, E. Standardized procedure to measure the size distribution of extracellular vesicles together with other particles in biofluids with microfluidic resistive pulse sensing. PLoS ONE. 16 (4), 0249603 (2021).

Tags

CyanobacteriaExtracellular VesiclesPurificationUltrafiltrationTangential Flow FiltrationConcentrationEnvironmental SamplesField SamplesCultureProtocol

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Biller, S. J., Muñoz-Marín, M. d. C., Lima, S., Matinha-Cardoso, J., Tamagnini, P., Oliveira, P. Isolation and Characterization of Cyanobacterial Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (180), e63481, doi:10.3791/63481 (2022).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image