軸索輸送の In Vivo イメージングのためのツールキットの拡張

すべてのマウスの取り扱いおよび実験は、動物(科学的手順)法(1986年)に従って行われ、ユニバーシティカレッジロンドン – クイーンスクエア神経学倫理委員会によって承認された。 1. 動物 すべての動物を温度と湿度が制御された環境で個別に換気されたケージに収容し、食物と水に自由にアクセスできる12時間の明暗サイクルでそれらを維持し ます 。 以下のトランスジェニック株の雄および雌マウスの両方を使用する:1)ヘテロ接合型Tg(Chat-EGFP)GH293Gsat/Mmcucdマウス(ChAT.eGFPマウスと呼ばれる);2)ヘテロ接合型 B6.Cg-Tg(Hlxb9-GFP)1Tmj/J、HB9と呼ばれる。GFPマウス;3)ヘテロ接合型 B6.Cg-Tg(Thy1-CFP/COX8A)S2Lich/J、Mito.CFPマウスと称される。 ChAT.Creマウスと呼ばれるホモ接合型B6;129S6-Chat tm2(cre)Lowl/Jと、Rosa26.tdTomatoマウスと呼ばれるホモ接合型 B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/Jを交配することにより、ChAT.tdTomatoマウスを生成する。 ヘテロ接合型ChAT.tdTomatoマウスとヘテロ接合型Mito.CFPマウスを交配することにより、ChAT.tdTomato::Mito.CFPマウスを生成する。 2. 蛍光HCの筋肉内注射 手術前準備 細菌中の改良型システインリッチタグに融合したHCT(HC T441、残基875〜1315)をグルタチオン-S-トランスフェラーゼ融合タンパク質として45に従って発現させる。AlexaFlour555C2マレイミド31でHC Tにラベルを付け、氷冷透析バッファー(10 mM HEPES-NaOH、100 mM NaCl、pH 7.4)で透析し、液体窒素で凍結し、-80°Cで保存します。 インビボ実験を行う前に、まず、初代ニューロンにおける取り込みおよび輸送の成功についてインビトロでHCTを試験する。 蛍光HCT(例えば、HCT-555)を、0.2mLチューブ中の滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中で、2.5〜10μg/μLの範囲の最終的かつ実験的に一貫した濃度に希釈する。このステップでは、必要に応じて、より多くの化合物/因子をHT溶液に追加します(例えば、脳由来神経栄養因子)。注:最終的なボリュームは、目的の筋肉のサイズに適切でなければなりません。例えば、前脛骨(TA)筋に3〜4μL、より小さなヒラメ筋に〜1μLの注射量を用意する。H C Tの作動濃度は、最終容量に関係なく2.5〜10μg/μLの範囲に保ちます。 ピペットまたはボルテックスを使用してHCT溶液を混合し、卓上遠心分離機を使用して低速で短時間スピンダウンして液体を収集し、大きな気泡を除去する。HCTを光や氷上での輸送から保護します。 小さな筋肉(ヒラメなど)への最適な筋肉内注射または坐骨神経内注射には、プルドガラスマイクロピペットを使用してください。手術前にグレーディングされたガラスマイクロピペット( 46による)を引っ張る。メモ:ピペッティングを有効にし、マイクロピペットの背面の上下の流しを制限するには、解剖顕微鏡下で細かい鉗子を使用して、鋭利な先端から小さなピースを慎重に取り外します。壊れた端は適切なビンに捨てるように注意してください。 使用前にすべての手術器具を滅菌して清掃してください。 手術 – 筋肉内注射 37°Cに設定したヒートマットに滅菌手術用ドレープを固定して手術の準備をします。 操作顕微鏡の位置と焦点を合わせます。手術を開始するには、滅菌済みの手術器具、サージカルテープ、滅菌綿棒、水中の70%(v/v)エタノール、滅菌生理食塩水、縫合糸、およびハミルトン針またはプルドガラスマイクロピペットを外科用ドレープに開梱します。 麻酔機械が外科的処置の期間中十分な酸素およびイソフルランを有することを確認する。麻酔の流れを誘導室に向け、麻酔装置の電源を入れます。 まず、1-2 L/minの酸素流量と5%のイソフルランを使用してください。マウスを誘導チャンバーに入れ、麻酔を開始する。右反射がない場合は、麻酔を2〜3%のイソフルランに減らし、麻酔の流れをマウスピースに向け、マウスを手術空間の別の領域に位置するマウスピースに移す。 注射する筋肉を覆う毛皮の領域を剃る前に、角膜反射とペダル離脱反射の両方が存在しないことを確認してください。完了したら、サージカルテープの粘着性のある側を使用してマウスからできるだけ多くの剃毛毛皮を取り除き、マウスを体重計の上に置き、手術前の体重を記録します。 綿棒を使用して眼滑剤を慎重に塗布し、マウスとマウスピースを手術領域に移します。注:手術領域にも移される剃毛された毛皮の量を制限するようにしてください。サージカルテープを使用してヘッドをマウスピースに固定し、マウスが滑り落ちるのを防ぎます。別の綿棒を使用して、剃毛した領域にエタノールを塗布し、毛皮の汚染を殺菌し、低減する。 注入する筋肉に応じて体を配置します。たとえば、TAの場合、マウスを背中に置き、正中線から約10°で後肢を伸ばします。あるいは、ヒラメ注射のために、動物をその側に置き、正中線から約45°で後肢を伸ばす。後肢が正しい位置にあるときは、手術中の不要な動きを防ぐために、足全体にサージカルテープを使用してください。注:TA、腓腹筋、およびヒラメ筋の注射手順は、以前に詳述されている32。 切開を行う前に、ペダル離脱反射をテストして麻酔が十分であることを確認してください。麻酔を継続的に監視し、呼吸と離脱反射の定期的な評価で外科的処置を通してそれを維持する。 この時点で、作業中のHCT溶液をハミルトンシリンジまたはプルドガラスマイクロピペットに引き込みます。 モーターエンドプレート領域46,47,48に対応する領域に、関心のある筋肉に小さな切開を行います。筋肉の外部筋膜を突き刺し、32に従ってHCをゆっくりと注入する。シリンジ/マイクロピペットを5〜10秒間所定の位置に置いてから、ゆっくりと引き出します。 切開部を1〜2本の縫合糸で閉じ、マウスを単離された回復ケージに移す。マウスを手術後、少なくとも30分間監視してから、自宅のケージに戻してください。マウスが正常に回復し、手術後のモニタリングが完了したら、ケージを通常の収容状態に戻します。 3. 生体内軸索輸送 坐骨神経の露出 顕微鏡環境チャンバーを少なくとも1時間前に37°Cに設定してください。 手術用ドレープ、工具、テープ、滅菌綿棒、70%エタノール、滅菌生理食塩水を手術領域の周りに配置して、坐骨神経を露出させる準備をします。麻酔機にマウス1匹あたり最大2時間、酸素とイソフルランの十分な貯蔵があることを確認してください。パラフィルムまたは目に見えないテープからくさびを、角度のついた先端を持つ狭い長方形(例えば、より大きなマウスの場合は〜1cmの幅)に切断し、露出した坐骨神経の下に置き、イメージングプロセスを支援します。誘導室をヒートマットの上に置き、体温に設定します。注:4時間は、HCが取り込まれ、注射部位から坐骨神経に逆行的に輸送されるのに十分な時間である。したがって、この時間後に1匹のマウスが再麻酔の準備をすることができます。 麻酔の流れを誘導室に導き、酸素流量1〜2L/minおよび3〜4%イソフルランで麻酔機の電源を入れ、マウスを誘導室に入れて麻酔を開始する。注: in vivo 軸索輸送実験は終末処置であるため、目を潤滑する必要はありません。 右反射がない場合は、麻酔を2〜3%のイソフルランに減らし、麻酔の流れをマウスピースに向け、マウスをマウスピースに移します。サージカルテープを使用してヘッドをマウスピースに固定し、ターゲットの後肢を正中線から約45°で伸ばし、この位置を維持するために足の上にサージカルテープを使用します。注:麻酔を減らすことは、イメージングプロセス中の呼吸アーチファクトの影響を制限できるため、この時点で有利です。 角膜およびペダル離脱反射が存在しないことを確認し、次いで、はさみを使用して、坐骨神経32 (すなわち、中枢脊髄から中下肢後肢まで延びる広い領域)を覆う皮膚を切り取る。上二頭筋大腿骨筋、ならびに坐骨神経の近くにある他の筋肉組織および結合組織を除去する。坐骨神経および周囲の血管、特に側腓腹筋頭の膝蓋骨/近位側面の外側側面の近くに位置する血管を損傷しないでください。 無傷の坐骨神経が十分に露出したら、乾燥を防ぐために坐骨神経の周りの領域に予め温められた滅菌生理食塩水を塗布する。湾曲した鉗子を使用して、深く横たわる結合組織を破壊し、事前に準備されたパラフィルム「くさび」を神経の下に置きます。完了したら、露出した領域に生理食塩水を浸したコットンウールを置き、O2中のイソフルランで満たされているはずのヒートマット(37°Cに設定)の上に置かれた誘導チャンバにマウスを移動します。 In vivo 軸索イメージングカスタマイズされた顕微鏡ステージに22 x 64 mmのカバーガラスを置き、テープでその位置を固定します。浸漬油を選択して対物レンズに塗布し、顕微鏡ステージを倒立顕微鏡に接続します。オイルとカバーガラスが接触するまで、オイル浸漬対物をゆっくりと持ち上げます。注:40倍、1.3開口数(NA)DICプランアポクロマットまたは63倍、1.4NA DICプランアポクロマットオイル浸漬対物レンズのいずれかを使用して、坐骨神経 のインビボ 輸送をイメージングできます。 麻酔マウスピースを顕微鏡ステージ上に移動させ、麻酔ホースをテープで固定して麻酔障害を防ぎます。坐骨神経からコットンウールを取り出し、露出した神経をカバーガラスに向けるように、マウスを誘導チャンバーからマウスピースに移します。サージカルテープを使用して、マウスの頭部がマウスピースに固定されていることを確認し、最低レベルの効果的な麻酔を維持します。マウスの尾をそっと持ち上げ、露出した坐骨神経の近くのカバースリップに滅菌生理食塩水を加えて、乾燥を制限し、イメージングを支援します。メモ:環境チャンバーのすべてのドアを閉じて、エリアが体温のままであることを確認してください。 眼を用いて、坐骨神経の位置を特定し、最適な焦点を決定し、運動性軸索小器官を含む関心領域を選択する。メモ: このプロセスの詳細な説明は、以前に説明されています32. 「 取得」 ボタン (または同等のもの) をクリックしてコンピューター・ソフトウェアに切り替え、関心のある領域を選択します。デジタルズームを使用して合計>80倍の倍率を取得し、選択した領域を回転させて軸索を水平に視覚化します(例えば、右から左に移動する逆行貨物と左から右に移動する順行貨物)。注: 方向性パラメーターはユーザーに依存しますが、実験全体で一貫性を保つ必要があります。 レーザー強度(0.2 – 1%)、ピンホールアパーチャ(1 AU – max)、ゲイン(マスター)(700 – 1000)、デジタルオフセット(-50 – 0)、デジタルゲイン(1.0 – 4.0)などのパラメータを調整して、信号強度を最適化します。光毒性の潜在的な影響を減らすには、レーザー強度を可能な限り≤ 1%に維持し、最大レーザー強度を 2% にします。最適な信号検出のためにレーザー強度を調整する前に、他のすべてのパラメータを変更します。 「領域」(または同等の領域) ボックスをクリックし、長方形の関心領域を選択してから、「取得モード」(または同等の領域)でフレームサイズを最小 1024 x 1024 ピクセルに設定し、100 ~ 1,000 フレームのタイムラプス取得を開始します。メモ:希望するフレーム集録レートはユーザに依存し(たとえば、搬送は0.1~6秒のフレームレートで評価できます)、関心領域、スキャン速度時間、集録平均化、レーザ指向性などのソフトウェアパラメータで調整できます。たとえば、フレームレートを遅くするには、関心領域の高さ/幅を大きくし、スキャン速度を遅くし、集録平均を増やし、単一のレーザー指向性を使用し、その逆も同様でフレームレートを高速化します。フレーム集録レートは、異なる周波数でのイメージングが不整合を引き起こす可能性があるため、比較可能なデータセット間で一貫している必要があります。シグナル伝達エンドソームのような速い貨物は、より遅い速度(例えば2.5-6秒)を用いて分析することができるミトコンドリアのような遅い細胞小器官と比較して、より速いフレームレート(例えば0.1-3秒)を必要とする。 マウス1匹あたり最低3軸索から最低10個の運動性貨物を捕獲することを目指しています。注:2サンプルの両面検出力計算(標準検出力0.8(1-β)およびI型エラー率5%(α))に基づくと、サンプルサイズ6~8は、野生型モデルと疾患モデル間の軸索輸送の違いを特定するのに十分です35,43。 画像化が完了したら、麻酔下にある間に直ちにマウスを安楽死させる(例えば、子宮頸部脱臼)。筋肉や坐骨神経などの死後組織も、さらなる分析のために採取することができる。